鼠疫耶尔森氏菌染色体上重要致病相关基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中表达鼠疫耶尔森氏菌染色体编码的重要致病相关基因。方法 运用生物信息学技术对鼠疫耶尔森氏菌基因组序列信息进行分析，选定了18个与病原菌粘附、侵袭宿主细胞相关的基因为克隆与表达的目的基因。通过PCR和TA克隆技术从鼠疫耶尔森氏菌基因组中克隆了这些目的基因。上述目的基因经双酶切回收后，分别导入原核表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Westernblot检测蛋白表达。结果 共获得14个可经IPTG诱导的高表达的重组转化子菌株。结论 上述重组转化子菌株表达的融合蛋白经进一步纯化可进行宿主感染鼠疫耶尔森氏菌后免疫应答的研究及抗体表达谱变化的研究。这些研究不仅对于鼠疫耶尔森氏菌致病机理的研究有意义，而且在鼠疫疫苗的研制上有重要价值。     

鼠疫耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的 对鼠疫菌的全DNA进行酶切，了解我国各别生态型的鼠疫耶尔森氏菌在核酸水平上的差异。方法 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分析。结果 用PFGE可将20株鼠疫菌分成5个核型，I型为布氏田鼠型和青海田鼠型菌；Ⅱ型为滇闽居民区型菌和滇西丛谷型菌；Ⅲ型为祁连山型、青藏高原型和1株分离自四川患的鼠疫菌。西藏仲巴地区的2株菌各为一个型。结论 提示脉冲场凝胶电泳分析可用于鼠疫耶尔森氏菌遗传关系的研究。     

鼠疫耶尔森菌的分子生物学研究进展

1 基因组结构、基因转移系统和调控 野生型鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌的染色体高度相关,而与小肠炎耶尔森菌关系并非如此密切。Y.pestis的基因组大小约为4 380±135Kb,GC比为46％～47％,尽管有噬菌体存在,但尚未发现原噬菌体和质粒的接合与转导能力。绝大多数分子生物学技术适用于Y.pestis已经可以用结合质粒和一些噬菌体完成遗传转移试验。已用标准技术完成了质粒的分离、转座子和噬菌体插入及融合突变。尽管Y.pestis的一般转化效率非常低,但电转移质粒是极为成功的。根据λ噬     

类Orientalis鼠疫耶尔森氏菌的基因分型及鼠疫大流行

在过去的1500年中，共发生过三次鼠疫大流行，鼠疫耶尔森氏菌引起了其中的第三次大流行。鼠疫耶尔森氏菌的DNA也在第二次大流行中人类的遗骸中发现。鼠疫耶尔森氏菌的Antiqua生物型可能引起了第一次大流行，其他的2种生物型，即Medievalis和Orientalis可能分别引起第二次和第三次大流行。为了验证这种假说，我们设计了一种称作“多间隔区(指基因组内已知基因间的DNA序列)分型法”的原始基因分型系统，该系统的原理是测量基因间间隔区的DNA序列。当多间隔区分型法用于分析可能死于第一次及     

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的　了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法　 PCR反应及 Southern杂交分析。结果　对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论　鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;该方法有助于鼠疫耶尔森氏菌与其它菌株的鉴别诊断     

青海省鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌的基因型分布

目的研究青海省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因型分布特征。方法对分离到的青海省148株鼠疫菌,根据已经证实的22个差异区段设计引物,每株鼠疫菌的每个基因差异区段都采用PCR技术进行验证。结果148株青海省鼠疫菌共包括8个基因型,即1、5、7、8、14型、新基因组型和Ype-ancestor型,其中以5型和8型为主。祁连山南麓和青海湖环湖地区的祁连、门源、刚察、海晏、共和、天峻等的菌株绝大多数属于基因型8型,占40．5％(60／148);位于青南高原的格尔木、玉树、扎多、治多、称多、囊谦和曲麻莱等的菌株,其基因型主要为5型,占31．8％(47／148)。青藏高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因型全部为14型,占8．1％(12／148)。结论在青海省分离的鼠疫菌中,喜马托雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌的基因型以5型和8型为主,青海田鼠疫源地鼠疫菌以基因型14型为主。     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统的研究现状

目前，已知耶尔森菌属包括11个菌种，其中只有3种对人类和啮齿类动物致病：鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis．以下简称鼠疫菌）、假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）和小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）。鼠疫（Plague）是由鼠疫菌引起的一种自然疫源性传染病，主要通过跳蚤叮咬而引起疾病的传播；而其他2种致病菌则主要通过食物进行传播（粪-口途径）．假结核菌可导致肠系膜淋巴结炎和败血症：     

贵州省鼠疫耶尔森菌生物学特征研究

目的研究贵州省鼠疫耶尔森菌的生物学特征,探讨疫源地性质。方法对37株鼠疫菌进行生化试验、营养需求试验、毒力基因检测、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场电泳分析。结果37株鼠疫菌均不发酵鼠李糖和甘油,发酵麦芽糖和阿拉伯糖,脱氮阳性。选择20株代表菌株检测均为苯丙氨酸依赖(Phe )、谷氨酸半依赖(Glu±);用Pla、Cafl、inv、hms4对引物分别进行PCR扩增,均得到456、249、1000和700bp的目标基因条带;随机引物(RAPD)分析均获得505、790、1140和1680bp的条带;脉冲场电泳图谱显示338、242.5、168和77kbp的条带。结论贵州省鼠疫菌株的生物学特征与云南省滇闽居民生态型鼠疫菌相同。     

陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究

目的 掌握陕西省鼠疫耶尔森菌分离株的MLVA基因分型特征,阐明不同疫情年份菌株间的遗传进化关系,为今后陕西省鼠疫的监测防治工作提供科学依据。方法 采用MLVA(14+12)方法,对分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶尔森菌进行基因分型,利用BioNumerics(Version7.6)软件对分型结果进行聚类分析。结果 66株鼠疫耶尔森菌分为A、B、C群,根据分离时间聚集成为相应群,A群包含42株菌,其中39株菌分离自2000-2001年,B群包含16株菌,其中15株分离自2006年,C群含8株菌,其中6株分离自1987-1988年。基因型分为19种,8个基因型为多菌株基因型,其他型为单菌株基因型。结论 陕西省鼠疫菌MLVA基因型具有多态性,不同疫情年份菌株主导的基因型不同,MLVA分型能够很好区分陕西省不同年代鼠疫菌株,可用于鼠疫菌株的溯源分析。     

鼠疫耶尔森氏菌LcrV基因的克隆与表达研究

目的研究鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)保护性抗原V蛋白的生物学活性,进而研究Y.pestis的致病机理.方法采用PCR方法,从Y.pestis菌种中扩增出LcrV基因片段,进行鉴定后,然后将该片段克隆于原核表达载体pBV220,构建成重组质粒pBV/LcrV,进行温控诱导表达.结果(1)获得长约980bp的PCR片段,序列分析结果与已知LcrV序列相同.(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量38×103处有表达条带.(3)经薄层扫描分析,目的蛋白条带占全菌蛋白的38.4%.(4)表达后菌体超声破碎后,目的蛋白主要存在于上清中.结论获得了LcrV基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物主要以可溶状态存在.     

我国青海田鼠与布氏田鼠鼠疫菌生物学特性的比较

目的通过对我国青海田鼠与布氏田鼠鼠疫菌生物学特性的比较,了解两种菌株的遗传特点及其亲缘关系。方法以生化、毒力因子、毒力、PstⅠ敏感性、质粒、外膜蛋白,重复片断扩增多态性指纹图谱,脉冲场电泳图谱等方法进行比较。结果青海田鼠与布氏田鼠鼠疫菌株的主要生化性状均为鼠李糖( )、麦芽糖( )、密二糖( )、甘油( )、阿胶糖(-)脱氮(-);具有FI 、VW 、Pgm 、PstⅠ ;对小白鼠表现为毒力强,青海田鼠型鼠疫菌对豚鼠的毒力高于布氏田鼠型鼠疫菌;两种菌株均对鼠疫菌(包括自身)产生的PstⅠ敏感;它们均携带(6、45、65)×106相对分子质量(Mr)3种质粒,外膜蛋白图谱均缺失32kd条带;重复片断扩增多态性指纹图表现出二者有近缘关系,脉冲场凝胶电泳图谱一致。结论青海田鼠与布氏田鼠鼠疫菌的生物学特性相似,有较近的亲缘关系。     

南方鼠疫菌对18种抗菌素的敏感性试验

目的 通过鼠疫菌对新型抗菌药物的敏感性实验,寻找比链霉素敏感性更高且毒性小的药物.方法 选用22株鼠疫菌对18种活性较高的抗菌素进行了纸片法药物敏感性试验.结果 头孢菌素类、青霉素类和喹诺酮类等多种药物对鼠疫菌的敏感性较链霉素好.结论 本试验结果可为鼠疫临床治疗选择新药提供参考资料.     

鼠疫菌fra基因探针的研究

利用ＰＣＲ的方法，由鼠疫菌的ＤＮＡ中扩增获得了单一的，长２４９ｂｐ的基因片段。这一反应的特异性良好，可以作为鼠疫菌的一种鉴定标志。将这一片段地高辛标记制成探针，与国外已经试用过的，来自９．５ｋｂ质粒的９００ｂｐ探针相比较，表明该探针的特异性优良，可用于鼠疫的监测与对鼠疫菌分子生物学的进一步研究。     

吉林西北部草原鼠疫菌染色体PCR指纹图谱分析

本通过PCR指纹图谱,分析了吉林西部草原鼠疫菌染色体NDA特征,结果显示该地区鼠疫菌染色体可产生8条非常明显的扩增区带,其他对照的菌株只产生6条扩增区带,分析认为这种差别可能是该地菌株的一特征。     

我国鼠疫耶尔森菌毒力特征研究

目的 研究我国各疫源地分离的鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)毒力特征.方法 以1943-2012年我国11块鼠疫自然疫源地不同时间、地区、宿主、媒介体内分离的894株鼠疫菌作为研究对象.将每株菌的37℃24h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液,比浊后稀释为2×101、2×102、2×103、2× 104、2×l05、2× 106、2×107、2×108、2×109个/ml,分别取0.5 ml皮下注射于小白鼠鼠鼷部,每组5只动物,分笼饲养观察14 d,动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养,以分离出鼠疫菌为特异性死亡,并计算半数致死量(LD50).结果 894株代表性菌株中,87.36％(781/894)属于强毒菌,4.36％(39/894)为中等毒力株,8.28％(74/894)为弱毒菌;对不同生态型鼠疫菌株进行毒力比较,青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的青藏高原型、祁连山型鼠疫菌绝大多数属于鼠疫强毒株,分别占94.42％(457/484)、93.10％(27/29).结论 我国各鼠疫自然疫源地鼠疫菌的毒力特征以鼠疫强毒株为主.     

我国鼠疫菌抗链霉素基因的监测

目的了解全国鼠疫菌分离株是否存在抗链霉素基因。方法根据Guiyoule等人在EMBL公布的抗链霉素相关基因,设计2对引物,对271株代表性鼠疫菌进行PCR扩增。结果实验用271株代表性菌株中尚未发现有鼠疫菌抗链霉素基因。结论目前在所实验的271株菌株还未发现鼠疫菌耐链霉素菌株。     

青海田鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化性状测定

目的通过对青海田鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌进行生化试验来测定其生化性状,并与喜玛拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌和布氏田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的差异进行比较研究。方法选择鼠李糖、甘油、麦芽糖、阿胶糖、蜜二糖、木胶糖、松三糖、乳糖、水杨素、山梨糖、甘露醇、七叶苷、糊精、蔗糖、半乳糖、纤维二糖、山梨醇、尿素、枸橼酸钠、和硝酸钾等项目进行生化试验。结果青海田鼠型菌株的生化性状,与其毗邻地理位置及生态环境一致,分离自喜玛拉雅旱獭的菌株有较大的差异。而与地理位置和生态环境相差甚远的布氏田鼠菌株其生化性状较接近。结论由此可见鼠疫菌的生化性状与宿主的关系更加密切。     

鼠疫菌特异基因的克隆表达和抗原性分析

目的 在大肠埃希菌中克隆表达鼠疫菌特异基因(YPO1089.pst、ymt),分析重组蛋白的抗原性.方法 利用PCR技术扩增目的 基因,PCR产物经纯化、双酶切后,与质粒载体pET-30a(+)相连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目标蛋白,并进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白免疫印迹分析其特异性,最后采用亲和层析法纯化诱导表达的融合蛋白.结果 成功构建了pET-YPO1089、pET-pst和pET-ymt 3个重组表达质粒,经优化诱导表达条件,重组的rYP01089、rPst和rYmt在大肠埃希菌中均得到了稳定高效地表达;免疫印迹结果表明重组的rPst可与鼠疫阳性血清发生特异性的免疫反应;目标蛋白经纯化后纯度可达95%以上.结论 鼠疫菌的特异性抗原能够在原核蛋白表达系统中获得高效表达,rPst具有敏感且特异的免疫学特性,实验结果为开发新型鼠疫诊断试剂奠定了基础.     

中国鼠疫菌随机引物扩增多态性指纹图谱

目的 对中国不同鼠疫自然疫源地鼠疫菌染色体的分析和比较发现其近缘关系进而从分子水平进行分型。方法 用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术。结果 第1条引物将中国的鼠疫菌分为11个类型，每个类型都有一定的条带规律和地理分布范围。第2条引物将我国的鼠疫菌分为5个类型。结论 随机扩增多态性DNA(RAPD)可以从分子水平用于我国鼠疫菌的分型。