融合蛋白 NrCAM-Fc的重组体的构建

目的：构建神经原相关的细胞粘附分子（NrCAM）和免疫球蛋白Fc片段融合基因的重组质粒并通过Baculovirus载体转染到昆虫细胞。方法：利用RT－PCR方法从神经母细胞瘤细胞系SK－N－SN获得NrCAM的信号肽区和跨膜区片段并直接克隆到pGEMT载体，经多次酶切、连接、转化、筛选获得NrCAM-Fc的重组副合基因，测序后将此基因通过Baculovirus载体转染至昆虫细胞。结果：多种酶切和测序结果表明NrCAM-Fc的序列与原序列符合率达98％以上，NrCAM与Fc连接处序列保证了Fc的读码框架（ORF）。结论：Baculovirus载体转染效率高，检测方法简便易行。     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

可溶型白细胞相关抗原B27分子基因的克隆与表达

目的 克隆和表达可溶型白细胞相关抗原（ＨＬＡ）－Ｂ２７分子的基因。方法 通过三轮聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法选择性删除编码跨膜单位的第５外显子而克隆得到可溶型ＨＬＡ－Ｂ２７基因,并以电转法将其转入人Ｂ淋巴细胞系,使其高效表达。结果 人Ｔ、Ｂ及单核细胞系及小鼠Ｌ细胞系在正常培养条件下均存在选择性剪切现象,而产生可溶型ＨＬＡ－Ｉ类分子。经ＰＣＲ方法克隆得到的可溶型ＨＬ－Ｂ２７基因,经酶切图谱鉴定及序列分析证实确为删除了第５外显子的ＨＬＡ－Ｂ２７分子的基因,将此克隆产物转入不含ＨＬＡ－Ｂ２７基因的细胞系Ｃ１Ｒ中,在其培养上清中检测到高水平的可溶型ＨＬＡ－Ｂ２７分子,其产量受培养温度、培养条件等因素影响。结论 ＨＬＡ－Ｂ２７分子前ｍＲＮＡ发生选择性剪切而导致跨膜单位丢失可产生溶型ＨＬＡ－Ｂ２７分子,该细胞系为将来研究环境     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

Bal b／c小鼠甘露聚糖结合凝集素—C基因的克隆与鉴定

目的：获得小鼠甘露聚糖结合凝集素－C（MBL－C）基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT－PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL－C基因cDNA片段，将其克隆入PUC－T载体并测序，对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果：扩增得到的Bal b/c小鼠MBL－C基因cDNA全长735bp，编码245个氨基酸残基，包含了完整的编码区基因序列，经核苷酸序列比较分析发现，扩增得到的Bal b/c小鼠BL－C基因与Genbank中发表的序列具有100％的同源性，与人的MBL基因的同源性为71．4％。结论：成功地克隆到完整的Bal b/c小鼠MBL－C编码区基因，为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。     

KiSS-1基因对卵巢癌细胞HO8910生物学行为影响的实验研究

目的探讨肿瘤转移抑制基因KiSS1对卵巢癌细胞株HO8910生物学行为的影响。方法含有人KiSS1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3KiSS-1经酶切和测序鉴定正确后,转染卵巢上皮癌细胞株HO8910,观察其KiSS1mRNA表达、细胞生长及增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果pcDNA3KiSS1成功转染HO8910细胞,KiSS1mRNA表达阳性,而亲本HO8910细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无显著性差异(P>0.05),但细胞侵袭能力明显下降(P<0.01),穿透Matrigel膜细胞数较未转染组明显减少(P<0.01)。结论KiSS1基因对卵巢上皮癌细胞HO8910的生长、增殖能力无影响,但可抑制其侵袭能力。     

人Lipocalin前列腺素D合酶的克隆表达及其抗体制备

目的 研究Lipocalin型前列腺素D合酶（L－PGDS）的编码蛋白质在大肠杆菌中的表达,进一步制备抗L－PGDS编码蛋白质的多克隆抗体。方法 用逆转录多聚酶链式反应（RT－PCR）方法克隆L－PGDS基因蛋白编码序列。构建该基因的表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,SDS－PAGE分析表达的蛋白质。用RediPack GST亲和层析柱纯化的蛋白质免疫BALB／c小鼠制备多抗。结果 RT－PCR所分离的L－PGDS基因蛋白编码序列,经测序证明与基因库所报道的L－PGDS的基因序列完全一致。SDS－PAGE分析证实该基因编码的蛋白质在大肠杆菌中表达,并获得效价为1：6400的多克隆抗体。结论 L－PGDS基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达,并能获得抗L－PGDS基因编码蛋白质的多克隆抗体,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础。     

ZNF217肿瘤基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对ZNF217肿瘤基因的shRNA表达载体,以用于后续的RNAi研究.方法 依据设计shRNA的原则,针对人ZNF217的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒,构建重组体PGenesil-ZNF217,进行测序鉴定,然后转染重组体至HO-8910细胞中.转染24 h后流式细胞仪检测转染率.结果 酶切及测序证实质粒PGenesil-ZNF217构建成功,转染24 h的HO-8910细胞发出绿色荧光.结论 成功构建的针对人ZNF217基因shRNA表达质粒PGenesil-ZNF217转染进人卵巢癌细胞株HO-8910细胞,为后续研究以及卵巢癌的基因治疗奠定了基础.     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的：构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础。方法：从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA，行RT－PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA，并克隆入pUCm-T测序载体。经DNA测序证实序列无误后，将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体。结果：经RT－PCR扩增出大小约为1．2kb的基因片段，成功克隆入pUCm-T载体。经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶（α1,3-galactosyltransferase,3GT），大小为1221bp，编码序列及读框均正确。经亚克隆酶切鉴定，获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcNDA3.1/V5-HisAα1,3GT。结论：成功地构建α1,3GT真核表达载体，为进行肿瘤基因治疗奠定了基础。     

RT-PCR一步法克隆人肝再生增强因子基因

目的 采用RT－PCR一步法，克隆人肝再生增强因子（hALR）编码序列。方法 按文献报道人肝再生增强因子核苷酸序列合成引物，提取人胎肝组织总RNA，利用一步RT－PCR法扩增人肝再生增强因子编码区基因；将PCR扩增片断克隆到pBV221质粒，构建原核表达载体。结果 获得长约400bp的hALPcDNA编码区基因，序列分析表明与文献报道一致。结论 通过RT－PCR一步法成功克隆人肝再生增强因子基因，为制备人ALR基因工程产品及研究其多种生物学作用奠定了基础。     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建

目的 构建嵌合跨模型CD55基因的重组逆病毒表达质粒。方法 采用PCR技术扩增编码CD155信号肽及成熟蛋白胞外区（-34-304aa)的DNA片段，双侧引入EcoRI、SspI位点，与编码CD46分子的跨膜区及膜内区（270～350aa)的DNA片段的5′未端自身的Stu I位点连接，构建嵌合跨模型CD55 DNA片段，序列测定后将此嵌合CD55片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒，酶切鉴定插入片段的方向。结果 DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5 DNA阅读框完整、连接部位序列正确；Hind Ⅲ酶切鉴定得到了正向插入的CD55TM-pLXSN重组表达质粒。结论 我们成功构建了嵌合跨膜型CD55 DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD55TM-pLXSN，为进一步在真核细胞中表达嵌合分子，比较研究GPI锚固型CD55分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。     

suc2基因的克隆及在酵母基因组中的定位突变

目的 克隆酿酒酵母的蔗糖转换酶基因（ｓｕｃ２）,并定位突变酵母基因组中的ｓｕｃ２基因以获得无蔗糖转换酶表达的酵母品系。方法 用ＰＣＲ法从酵母Ｙ１９０基因组中扩增出ｓｕｃ２的成熟肽基因片段,克隆后测序。将色氨酸合成酶（ＴＲＰ）基因片段插入ｓｕｃ２基因中,构建成用于同源重组的ｓｕｃ２基因定位突变载体。导入酵母Ｙ１９０,用营养缺陷筛选出ｓｕｃ２基因突变的克隆。用ＰＣＲ扩增并克隆突变后的ｓｕｃ２基因,用序     

基质金属蛋白酶-2C端片段pex的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 :克隆小鼠基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 ) C端片断 pex编码区的 c DNA序列 ,并构建其真核表达载体 ,为进一步研究其抑制肿瘤作用奠定基础。方法 :根据基因 Gen Bank中 MMP- 2基因的碱基序列 ,利用 RT- PCR的方法从 NIH3T3细胞中分别扩增信号肽及目的基因 pex,然后用多重 PCR的方法将两个片段拼接起来 ,再将拼接起来的目的片段 sig- pex与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,利用亚克隆的方法将 sig- pex c DNA片段克隆到 pc DNA3.1载体中。结果 :DNA测序证实该片断序列与文献报道完全一致。结论 :成功构建出 pc DNA3.1 - sig- pex真核表达载体     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

Cloning of NHE-1 gene fragment from human lung can.cer cells and construction of its antisense expression vector

Objective: To clone the partial sequence of Na^ /H^ exchanger- 1 (NHE- 1) gene of human lung cancer cells and insert it reversely into the multiclone site of pLXSN in order to construct an antisense expression vector for tumor gene therapy it~ vivo. Methods: With use of the upstream and downstream primers containing Barn H I and EcoR I in their 5‘ ends respectively, a partial sequence of the first exon of NHE-1 gene was cloned in a length of 454 bp from genomic DNA of human lung cancer cell A549 with PCR method. The product was then direetionally and reversely insert into the multiclone site of pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results: The cloned fragment was 461 bp in length and successfully ligated to pLXSN with the identification by agarose gel etectrophoresis. DNA sequencing confirmed that the fragment cloned and inserted into the vector was identical with the targeted one. Conclusion: The targeted fragment is successfully cloned and reversely inserted into pLXSN in our experiment. The antisense expression vector of NHE-1, pNHE-1, was constructed successfully.     

BALB/c小鼠H-2Kd胞外段基因 cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆小鼠H-2K^d胞外段基因，构建相关表达载体。方法 通过逆转录-聚合酶链反应（RTP-PCR）技术从BALB／c品系小鼠（H-2K^d）脾细胞中扩增出目的基因，构建载体后进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果 克隆基因产物鉴定结果与理论预期值一致，DNA测序完全吻合。结论 该实验克隆H-2K^d基因胞外段成功。     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆

目的：分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体，并探讨其意义。方法：设计2对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点，以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中，并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果：K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论：LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行，可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。