大鼠谷胱甘肽S—转移酶P1基因增强因子及其反式作用因子的研究

探讨大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因上游增强子元件及作用于其上特异性结合蛋白与该基因在癌细胞中高表达的关系，用荧光素酶的报告系统在ＨｅＬａ及ＣＢＲＨ７９１９细胞中增强子元件Ｉ（ＧＰＥ Ｉ）及增强子元件Ⅱ（ＧＰＥⅡ）的活性，并将ＧＰＥⅡ的增强子活性部位定位于其上游８４ｂｐ的ＧＰＥⅡ－１区域内。分析对比不同细胞中结合于ＧＰＥⅠ核心序列（ｃＧＰＥⅠ）、ＧＰＥⅡ－１上特异性核合蛋白，发现ＨｅＬａＣＢＲＨ７９     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅱ启动子功能区缺失分析的初探

木聚糖酶Ⅱ(Xylanase Ⅱ)是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一．序列分析显示其1．1kh的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点，可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控．以编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的E．coli uidA基因为报告基因，分别与木聚糖酶Ⅱ启动子及功能区(-312～-1080)缺失启动子融合，构建报告质粒pXIIPU与pXIIP△EXU，引入瑞氏木霉蛋白酶缺陷株Trichoderma reesei RutC30U4．先后对转化子进行发酵实验，测定GUS活性。结果显示功能区-312～-1080缺失后的启动子活性是原启动子活性的19％．结果表明在缺失的木聚糖酶Ⅱ启动子-312～-1080区仍存在调节转录活性的顺式作用元件，值得进一步研究．     

OSP-1启动子在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性研究

为获得能在猪卵巢颗粒细胞中高效表达的启动子,本文检测了大鼠卵巢特异性启动子OSP-1(Ovarian specific promoter)在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性。参考大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,Realtime-RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果表明:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光。Realtime-RT-PCR结果显示:Zs GREEN基因在卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低;说明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,可为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。     

凋亡素融合蛋白在HeLa细胞中的转导及体外活性分析

研究胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)的肝素结合域(HBD)在HeLa细胞中的转导活性,并证实HBD具有运载药物蛋白(凋亡素)进入细胞并诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过克隆表达的HBD-EGFP融合蛋白经Ni2+-NTA纯化后,观察其转导活性;并利用HBD-凋亡素融合蛋白表达纯化后,用噻唑蓝(MTT法)检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明:用荧光显微镜可观察到HeLa细胞内有绿色荧光;MTT法检测表明凋亡素融合蛋白能诱导HeLa细胞的凋亡;HBD具有转导活性,能携带药物蛋白(凋亡素)进入细胞并能诱导HeLa细胞的凋亡。     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

甲基化CpG结合结构域蛋白的原核表达及应用

本文构建了甲基化CpG结合结构域(MBD)蛋白的原核表达质粒,并表达了GSTMBD融合蛋白,采用GST柱对该融合蛋白进行纯化.体外pull-down实验发现,GST-MBD融合蛋白能够与小鼠胚胎成纤维细胞MEF中oct4基因的启动子DNA结合,验证了该蛋白的体外生物活性.利用相同的实验方法,发现GST-MBD融合蛋白能够与MEF细胞中inhbb基因的启动子区结合,而不能与小鼠胚胎干细胞R1中的inhbb基因的启动子区DNA结合,同时采用半定量PCR方法检测到inhbb基因在R1细胞中高表达,而在MEF细胞中不表达,表明inhbb基因受到DNA甲基化的调控.     

大鼠小脑特异基因Zic的克隆、序列分析和初步表达

EST（AW055732）片段是SD大鼠脑内一特异表达基因cDNA的3‘-端片段,与小鼠和人的Zic基因同源。基于小鼠及人的Zic基因的同源序列,设计引物用PCR方法从SD大鼠中克隆得到该基因的编码区序列（rZic)。该基因编码一锌指蛋白,其锌指结构域与线虫的tra-1基因,果蝇的ci^D基因。人的Gli癌基因和果蝇的opa基因的锌指结构域高度同源,用RT－PCR方法分析了rZic基因在大鼠脑区分布状况。结果表明,rZic基因在小脑中高表达。将该rZic基因克隆至带有6个组氨酸的表达载体pET-32a( )中,用IPTG诱导rZic融合蛋白在大肠杆菌BL21菌株中表达,诱导后重组蛋白质占菌体总蛋白的20．8％。     

人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

七鳃鳗PHB2的真核表达与亚细胞定位

以东北七鳃鳗心肌总RNA 反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增 PHB2基因全长CDS区,并将其定向克隆至真核表达载体 pEGFP‐N1上,构建真核重组载体pEGFP‐N1‐Lm‐PHB2．提取重组质粒,去除内毒素,利用脂质体介导的方法转染CHL、HeLa和MCF‐7细胞,通过Western Blot检测转染后 Lm‐PHB2是否表达,Confocal观察EGFP融合蛋白在细胞中的表达及亚细胞定位．结果表明：PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切和测序证明真核表达载体构建成功;Western Blot检测到Lm‐PHB2蛋白条带,Confocal观察到绿色荧光蛋白GFP ,证明真核重组载体成功表达;Lm‐PHB2蛋白主要定位在CHL细胞的细胞核,少量存在于基质和线粒体中,而在 HeLa和MCF‐7细胞中,Lm‐PHB2蛋白集中定位在细胞核中．本研究为七鳃鳗Lm‐PHB2的功能研究奠定了重要基础．     

神经元素3蛋白(Ngn3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素表达细胞分化的初步研究

胰腺发育相关基因神经元素3（neurogenin3,Ngn3）,属于碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）家族的转录因子,对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要,且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质．之前的研究发现,全长Ngn3蛋白具有蛋白质转导功能,可以高效进入多种真核细胞系．近年来多项研究显示,骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞．利用蛋白质转导技术,将体外表达纯化的胰腺发育重要因子Ngn3蛋白导人体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞中,诱导其向胰岛素表达细胞分化．结果显示,经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象,并有形状类似胰岛的细胞团出现．RT-PCR结果显示经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞可以有效表达胰岛素,并且一些β细胞相关基因如胰十二指肠同源盒基因-1（pancreatic-duodenal homeoboxl,Pdx-1）,神经分化因子（neurogenic differentiation,NeuroD）,同源结构域基因4（pairedboxgene4,Pax4）,葡萄糖转运体-2（gluoase transporter2,Glut-2）都有表达．细胞免疫荧光也可检测到胰岛素的表达．通过Ngn3蛋白质诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞的初步研究,探索了应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得胰岛素表达细胞的可行性,为糖尿病治疗提供一定的实验依据．     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒,筛选其高效表达工程菌,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEX HTb质粒Nco Ⅰ/HindⅢ位点,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆,IPTG诱导工程菌后以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况,并测定其抗原性和生物学活性,结果成功构建了工程菌Top1O F'[hIL-2/IFN-γ],经优化表达条件后,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,分子质量约为34 ku.ELISA和Western-blot实验结果表明,目的蛋白能特异性结合抗IFN-γ抗体,呈阳性反应,生物学活性测定显示其IL-2和IFN-γ比活性分别为1.7×107U/mg与3.2×106U/mg.     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

1q42.3染色质区域一个前列腺癌特异性超级增强子样元件通过染色质相互作用促进细胞迁移

前列腺癌在全球男性中发病率居于前列,遗传因素是影响前列腺癌发生发展的主要因素. 研究报道1号染色体长臂42 区3 带至43 区(1q42.3-43)存在一个潜在的前列腺癌易感染色体座位,但这个易感座位与肿瘤关联的分子机制迄今未得到确认. 增强子是能够改变染色质活化状态的DNA 序列,通过精准调控基因时空表达从而决定细胞身份命运. 通过ChIP-seq 发现1q42.3 染色质区域存在一个前列腺癌特异性超级增强子样元件;利用CRISPR/Cas9 系统敲除该区段后发现细胞迁移能力明显降低,并利用RNA-seq 筛选出多个差异表达的基因;通过Hi-C 鉴定出与该超级增强子样元件相互作用的染色质区段;最后将RNA-seq 和Hi-C 进行综合分析预测出该超级增强子样元件直接调控的基因.     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

基于RNA-seq的HBSS诱导细胞自噬的组学分析及实验验证

为寻找Hank’s平衡盐溶液(HBSS)诱导细胞自噬的调控蛋白,对HBSS诱导大鼠肾上皮(NRK)细胞株的细胞自噬现象进行转录组分析和实验验证.用HBSS分别处理细胞不同时长,结合LC3B-Ⅱ蛋白表达量和细胞存活率确定最佳诱导时间.根据最佳诱导时间制作细胞样品,进行转录组测序(RNA-seq),原始数据质控过滤后进行注释和分析.选取表达差异变化排序靠前的基因进行敲降实验,筛选具有潜在调控功能的蛋白质,接着用荧光定量PCR实验对该蛋白质的上游基因表达情况进行辅助验证.结果发现,HBSS诱导细胞自噬的最佳诱导时间为3 h;在转录组结果中共鉴定到32 305个基因,477个差异表达基因,差异基因的GO和KEGG富集分析结果显示这些基因主要参与代谢底物分解、氨基酸转运以及蛋白质修饰调控等信号调控通路;免疫印迹结果表明干扰基因Sat1的表达可以降低细胞内LC3B-Ⅱ的表达水平.本研究围绕HBSS诱导细胞自噬进行转录组学测序分析,并通过实验发现了影响LC3B-Ⅱ表达的潜在功能调控基因Sat1.综合考虑所有实验结果,Sat1可能通过GO和KEGG显著富集的信号通路影响HBSS诱导的细胞自噬,这些发现...     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.