淫羊藿素通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成软骨分化

该文研究GDF-5联合淫羊藿素(ICT)诱导BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt信号通路在其中的作用。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞分成6组:BMSCs组,ICT组,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组,GDF-5+ICT+XAV-939组,连续诱导培养14 d。倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖变化;RT-PCR检测aggrecan,Col2,Sox9,Dvl1,Gsk3β,β-catenin mRNA表达水平;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达水平。结果提示,与BMSCs组相比,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组蛋白聚糖Alcian blue染色均明显较深;成软骨分化标记基因aggrecan,Col2,Sox9 mRNA表达水平及Ⅱ型胶原蛋白表达水平,Wnt信号通路相关基因β-catenin mRNA及蛋白表达均逐渐增加,Gsk3βmRNA表达量逐渐减少。相反,相对于GDF-5+ICT组,添加XAV-939组则表现为成软骨分化及Wnt信号通路相关基因Dvl1,β-catenin表达下调,Gsk3βmRNA表达增加,Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达水平均下降,上述差异均有统计学意义。GDF-5联合淫羊藿素能够诱导大鼠BMSCs成软骨分化,其中ICT起促进作用。ICT可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs体外成软骨分化。     

梓醇对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖和成软骨分化能力的影响

目的探讨梓醇对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外增殖和成软骨分化能力的影响。方法全骨髓贴壁筛选法培养BMSCs,取第3代细胞用于实验,并作成骨、成脂分化鉴定。CCK-8法检测25、50、100、200μmol/L梓醇在12、24、36 h对BMSCs增殖效应,选取含50、100、150μmol/L梓醇的经典诱导液、经典诱导液、普通培养基诱导BMSCs成软骨分化,诱导3周后,HE染色观察成软骨大小。选取相同浓度的梓醇、经典诱导液、普通培养基培养BMSCs12 h后,实时荧光定量PCR检测COL1、Aggrecan和SOX9基因表达。结果不同浓度的梓醇对BMSCs均无毒性作用,24 h后不同浓度的梓醇都可促进BMSCs增殖,随着梓醇浓度增大及作用时间的延长,BMSCs增殖也明显增加,与空白正常组比较均有统计学意义(P<0.01)。HE染色观察,加入含150μmol/L梓醇的经典诱导组诱导的软骨小球较单纯经典诱导液组大,而PCR结果显示与空白组比较,不同浓度组梓醇均能提高COL1、Aggrecan和SOX9基因表达(P<0.01),与经典诱导组比较,低、中剂量的梓醇组可以提高COL1基因的表达(P<0.05),高剂量梓醇可提高Aggrecan基因的表达(P<0.05),高、中、低剂量梓醇组都可以提高SOX9的基因的表达(P<0.05)。然而,经典诱导组SOX9表达量与空白组比较没有明显统计学差异(P>0.05)。结论梓醇能促进大鼠BMSCs体外增殖,与时间和浓度成正相关,亦能促进大鼠BMSCs体外成软骨分化,可能与促进COL1、Aggrecan基因表达相关。     

牛膝对人软骨细胞体外增殖的影响

目的:探讨牛膝对人关节软骨细胞体外增殖的影响。方法:膝骨关节炎患者口服不同浓度牛膝醇提物,收集不同浓度牛膝含药血清,取膝骨关节炎行关节置换手术患者的关节软骨,剪碎后,采用Ⅱ型胶原酶溶解消化软骨细胞,甲苯胺蓝染色确定软骨细胞的存在。将第3代软骨细胞分别接种于4组:空白对照组、含药血清高剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组。荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞形态和结构,采用CCK-8法检测软骨细胞增殖情况,RT-PCR法分析软骨细胞基因Ⅱ型胶原mRNA表达水平。结果:牛膝含药血清高、中剂量组细胞增殖率高于对照组(P0.05),含药血清低剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);RT-PCR法检测结果显示牛膝含药血清高、中、低剂量组均高于空白对照组(P0.05)。结论:牛膝含药血清能促进人软骨细胞体外培养增殖和Ⅱ型胶原的合成。     

牛膝醇提物体内诱导兔骨关节炎模型软骨修复的病理学观察

目的:观察牛膝醇提物对兔骨关节炎模型软骨病理学改变的影响.方法:将36例实验兔分为空白组(4只)和骨关节炎模型组(32只),对骨关节炎模型组动物采用关节伸直拉制动法进行造模.将造模成功的26只实验兔随机分为骨关节炎模型对照组、骨关节炎模型治疗组,各13只,分别予蒸馏水、牛膝醇提物灌胃4周后进行关节粘连改善度测定以及软骨病理标本大体观察、Pelletier评分、HE染色、Mankin's评分、Ⅱ型胶原表达免疫组化检测.结果:灌胃4周后,骨关节炎模型对照组关节粘连改善度为(69.17±5.13)°,骨关节炎模型治疗组为(87.08±5.32)°,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);前者Pelletier评分为(2.83±0.30),后者为(2.75±0.33),两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);前者软骨细胞数量明显减少,基质染色变浅,Mankin's评分(6.91±0.53),后者软骨细胞数量增多,软骨细胞呈卵圆形,潮线结构恢复正常,Mankin's评分为(3.67±0.47),两组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01);Ⅱ型胶原表达阳性百分率比较,前者为(32.05±13.78)％,后者为(44.45±12.62)％,两组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01).结论:牛膝醇提物能改善关节粘连,有效刺激软骨细胞增殖,增加软骨Ⅱ型胶原表达,恢复软骨基质成分,稳定潮线结构,修复软骨损伤.     

淫羊藿苷对骨性关节炎家兔BMSCs增殖及软骨定向分化影响的实验研究

目的:观察淫羊藿苷(ICA)对骨性关节炎(OA)家兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖及软骨定向分化的影响。方法:选用6月龄家兔采用Hulth法复制OA动物模型,全骨髓贴壁法分离培养OA家兔BMSCs。根据ICA的不同浓度分为25p M、50p M、0.1p M、0.2p M、0.4p M、0.8p M ICA组,并设空白组,运用MTT法检测不同浓度ICA对BMSCs增殖的影响。将BMSCs分为空白组,4μM、1μM、0.25μM ICA组,经典诱导组及1μM ICA+经典诱导组,运用免疫细胞化学方法检测Ⅱ型胶原的表达,运用阿利新蓝比色法测定各组葡萄糖氨基聚糖(GAG)的含量。结果:全骨髓贴壁分离法可获得优质性较好的BMSCs,体外培养下OA家兔BMSCs软骨定向分化能力下降,而脂向分化能力增强。MTT法检测ICA对BMSCs的增殖作用,结果发现0.1p M、0.2p M、0.4p M、0.8p M ICA组的OD值较空白组高(P0.01)。4μM、1μM、0.25μM ICA组,经典诱导组及1μM ICA+经典诱导组的Ⅱ型胶原表达的阳性率、CAG含量均高于空白组(P0.05或P0.01)。结论:ICA能明显促进OA家兔BMSCs的体外增殖及软骨定向分化。     

黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的特性

目的观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响,为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝(MTT)法筛选出黄芪多糖的合适浓度,取F3代细胞,采用随机数字表法分为对照组和诱导组(神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导),采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脂蛋白酯酶(LPL)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示,在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显,甲苯胺蓝染色阳性,而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达,LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞,而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。     

CCK-8法检测牛膝醇提物体外诱导兔BMSCs增殖活性的研究

目的:研究牛膝醇提物含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖的影响。方法:采用高、中、低剂量牛膝醇提物以及等体积生理盐水对SD级新西兰大白兔进行灌胃,从中提取含药血清,同时采用贴壁筛选法培养兔骨髓间充质干细胞,并以4种不同浓度的含药血清及胎牛血清分别干预第三代骨髓间充质干细胞。于干预后第3、6、9天分别3次采用CCK-8法测定细胞光密度值(OD),比较各组间的差异。结果:高剂量组牛膝醇提物含药血清刺激骨髓间充质干细胞增殖,并促进细胞分化,其OD均值与其他组相比较最高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:牛膝醇提物含药血清具有促进BMSCs增殖作用,其中高剂量作用最强。     

加味阳和汤含药血清联合转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 探究加味阳和汤含药血清联合转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。方法 全骨髓贴壁培养法分离培养SD大鼠BMSCs,并进行流式细胞术鉴定;CCK-8实验筛选出加味阳和汤含药血清促进BMSCs增殖的最佳有效浓度;将第3代BMSCs分为空白对照组、加味阳和汤含药血清组(含药血清组)、TGF-β1组(阳性对照组)、加味阳和汤含药血清联合TGF-β1组(联合组),诱导分化21 d后,阿利新蓝染色检测软骨特异性基质蛋白糖胺聚糖生成;RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测软骨分化标记基因SOX-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因蛋白表达。结果 (1)阿利新蓝染色显示,空白对照组未见明显软骨特异性基质蛋白糖胺聚糖(呈蓝色)产生,其余3组可见明显糖胺聚糖生成,其中联合组效果最佳;(2)与空白对照组比较,Aggrecan、ColⅡ及SOX-9的基因蛋白表达均明显升高(P<0.05),其中联合组效果最佳(P<0.01),且明显优于含药血清组和阳性对照组。结论 加味阳和汤含药血清在一定浓度范围...     

右归饮诱导的骨髓间充质干细胞/纤维蛋白胶复合物对膝关节软骨缺损兔软骨修复的影响

目的观察右归饮对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨分化的效果及其诱导的BMSCs/纤维蛋白胶复合物对兔膝关节软骨缺损的修复效果。方法分离兔胫骨和股骨骨髓细胞,传代培养得到兔BMSCs,将兔BMSCs分为对照组、诱导组和右归饮低、中、高剂量组,检测BMSCs细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白多糖mRNA和蛋白表达情况,筛选右归饮后续实验浓度。将膝关节软骨损伤模型兔随机分为5组,每组6只,其中右归饮组将经筛选浓度的右归饮诱导1周的BMSCs/纤维蛋白胶复合物植入兔软骨缺损部位; TGF-β1组将经转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导1周的BMSCs/纤维蛋白胶复合物植入兔软骨缺损部位;纤维蛋白胶组将纤维蛋白胶植入兔软骨缺损部分;模型组缺损旷置;另设正常对照组不做任何处理。各组均干预8周后,取膝关节软骨缺损部位,通过大体观察、HE染色及Wakitani评分评估软骨损伤修复效果。结果与对照组比较,右归饮中、高剂量组Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白多糖mRNA和蛋白水平均明显上调,且以右归饮高剂量组效果最好(P 0. 05),故选右归饮400 mg/ml进行后续实验。正常对照组兔膝关节形态正常,表面光滑,无损伤;模型组兔膝关节软骨缺损处呈暗红色,软骨缺损处组织结构不规则,未见软骨细胞,仅可见少量纤维组织,软骨组织Wakitani评分升高(P 0. 05)。纤维蛋白胶组兔膝关节软骨缺损面积变小,软骨缺损处有修复填充物,Wakitani评分降低(P 0. 05)。与纤维蛋白胶组比较,右归饮组和TGF-β1组兔膝关节软骨缺损基本修复完整,修复部位HE染色与周边正常组织较为接近,可见大量软骨细胞,出现软骨陷窝结构,软骨组织Wakitani评分降低(P 0. 05)。结论右归饮可诱导兔BMSCs的成软骨分化,其所诱导的BMSCs/纤维蛋白胶复合物对兔膝关节软骨缺损修复具有促进作用。     

牛膝醇提物对肾脏转移生长因子蛋白表达的影响

目的:探讨牛膝醇提物对自发性高血压大鼠(SHR)肾脏转移生长因子(TGF-β1)的影响.方法:将40只SHR随机分为5组:空白组、牛膝醇提物高、中、低剂量组、依那普力组,每组8只.8周后,摘取肾脏,检测大鼠肾脏转移生长因子的蛋白表达.结果:川牛膝醇提物随着剂量的升高,可明显降低肾组织细胞中TGF-β1蛋白的表达,并且川牛膝醇提物高剂量组的作用与依那普利组比较无显著差异.结论:川牛膝醇提物具有抑制转化生长因子生成的作用,通过减少肾组织的纤维化,可能降低TGF-β1对肾小球细胞的刺激,减少肾素的释放,减少血管紧张素Ⅱ的生成,从而使血管舒张,血压下降.     

淫羊藿甙诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化实验研究

目的:观察淫羊藿甙对人骨髓间充质干细胞(h MSCs)向软骨细胞诱导分化的作用。方法:骨髓样本取自广州中医药大学第一附属医院关节一科因骨关节炎行全髋关节置换手术的病人,用含有1m L肝素(100 U/m L)的注射器抽取骨髓5 m L,并立即送入实验室进行体外培养。收集体外增殖培养第3代的细胞,分5组:未诱导组、对照组、淫羊藿甙低剂量组、淫羊藿甙中剂量组、淫羊藿甙高剂量组。置于细胞培养箱培养,隔天换液1次,培养21天。甲苯胺蓝染色及SABC免疫组化法检测软骨细胞,并定量测定胶原α1m RNA表达水平。结果:甲苯胺蓝染色鉴定:淫羊藿甙高剂量组和对照组染色均可见胞浆成紫红色质,表明糖氨聚糖含量丰富,h MSCs向软骨细胞分化;淫羊藿甙低、中剂量组及未诱导组染色未见特征性紫红色异染,表明h MSCs未见明显软骨分化。Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定:淫羊藿甙高剂量组和对照组免疫组化染色后可见棕黄色胶原颗粒,淫羊藿甙高剂量组最为密集,表明Ⅱ型胶原含量多,h MSCs向软骨细胞分化显著;淫羊藿甙低、中剂量组见少量棕黄色胶原;未诱导组未见胶原染色。从荧光定量PCR检测结果分析,淫羊藿甙高剂量组、对照组Ⅱ型胶原相对表达量较高,2组比较,差异无统计学意义(P0.05)。淫羊藿甙低、中剂量组Ⅱ型胶原相对表达量较低,2组比较,差异无统计学意义(P0.05)。未诱导组无胶原表达。结论:淫羊藿甙可在体外诱导h MSCs分化为软骨细胞。     

补肾活血汤含药血清干预体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化及补肾活血汤联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠膝骨关节炎的实验研究

目的:观察补肾活血汤含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)成软骨分化的作用,及补肾活血汤联合BMSC治疗大鼠膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的作用。方法:从4周龄SD大鼠股骨中分离培养BMSC,以8周龄SD大鼠制备补肾活血汤含药血清和空白血清。选择体外培养的第3代BMSC,分为3组,分别加入含10%空白血清的DMEM培养液(空白组)、含10%空白血清的DMEM培养液及基础诱导液(诱导组)、含10%补肾活血汤含药血清的DMEM培养液及基础诱导液(含药血清组),干预后分别进行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,并以Real-time PCR法检测各组细胞中Ⅱ型胶原mRNA、聚集蛋白聚糖mRNA的水平。取18只8周龄SD大鼠,随机分为模型组、BMSC组及联合组,每组6只。通过切断右前交叉韧带对各组大鼠进行KOA造模。造模术后1周,向BMSC组与联合组大鼠右侧膝关节腔内注射5×10~6个·m L^-1BMSC-PBS溶液(每次0.1 m L,每周1次),向模型组大鼠右侧膝关节腔注射等量PBS溶液;联合组在关节腔注射的基础上每天以补肾活血汤灌胃(每次4 m L,每天1次)。干预8周后处死大鼠,取右侧膝关节软骨及软骨下骨组织,HE染色后在光学显微镜下观察。结果:干预7 d后,含药血清组细胞甲苯胺蓝染色呈阳性,细胞质呈蓝紫色;空白组和诱导组染色均为阴性。干预14 d后,含药血清组染色进一步加深,染色面积增大,呈明显的紫蓝色;空白组染色为阴性,诱导组可见少量蓝紫色染色。干预7 d、14 d后,Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,空白组细胞均未见明显阳性染色,诱导组及含药血清组细胞胞浆和细胞间质内呈棕黄色或棕褐色染色,其中干预14 d后含药血清组细胞内染色深于诱导组。干预7 d后,3组大鼠BMSC中Ⅱ型胶原mRNA水平、聚集蛋白聚糖mRNA水平比较,组间差异均有统计学意义(1.02±0.23,1.33±0.11,2.11±0.23,F=47.181,P=0.000;1.03±0.32,1.36±0.16,1.93±0.10,F=26.508,P=0.000)。含药血清组的Ⅱ型胶原mRNA水平、聚集蛋白聚糖mRNA水平均高于空白组和诱导组(P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000),诱导组的Ⅱ型胶原mRNA水平、聚集蛋白聚糖mRNA水平均高于空白组(P=0.017;P=0.029)。药物干预8周后,模型组大鼠膝关节软骨表面粗糙,破坏严重,可见明显纤维增生;BMSC组软骨可见部分修复,表面仍较粗糙,细胞纤维化不明显;联合组关节软骨面光滑,软骨表面磨损不明显,无软骨表面纤维化。结论:补肾活血汤含药血清能有效促进体外培养的大鼠BMSC向软骨细胞分化;补肾活血汤灌胃联合BMSC膝关节腔内注射能有效防治KOA大鼠膝关节软骨破坏。     

音猬因子复合海藻酸钠水凝胶修复大鼠膝关节软骨缺损

目的:探讨音猬因子(Shh)复合海藻酸钠水凝胶对大鼠膝关节软骨缺损的修复作用。方法:培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs),制备音猬因子复合海藻酸钠水凝胶。采用随机对照动物观察实验,选择6周龄48只健康SPF级SD雄性大鼠,全部建立膝关节软骨缺损模型,随后随机分为损伤组、观察组、对照组3组,每组16只。损伤组不进行任何处理;对照组植入不含音猬因子的海藻酸钠水凝胶25μL与BMSCs悬液25μL;观察组植入含音猬因子的海藻酸钠水凝胶25μL与BMSCs悬液25μL。12周后各组大鼠接受安乐死并观察膝关节软骨缺损和修复的效果,采用国际软骨修复协会(ICRS)评分评估,并用苏木精-伊红(HE)染色和番红O染色检测膝关节软骨组织变化,用免疫组织化学法检测各组中Ⅱ型胶原蛋白的表达,用qRT-PCR法检测各组中Sox9和糖胺多糖(GAG)的mRNA表达水平。结果:与损伤组比,对照组和观察组大鼠的ICRS评分增加,膝关节软骨组织损伤明显改善,软骨厚度明显增加,Ⅱ型胶原、Sox9 mRNA和GAG mRNA的表达水平都上调(P<0.05)。与对照组比,观察组大鼠的ICRS评分增加,膝关节软骨组织损...     

益心泰醇提物对血管紧张素Ⅱ诱导的兔心肌成纤维细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的观察益心泰醇提物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的兔心肌成纤维细胞(CFs)Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,探讨其抗心肌纤维化的作用机制。方法提取新生兔CFs,细胞分为对照组、模型组、氯沙坦钾组和益心泰醇提物低、中、高剂量组。除对照组外,其余各组细胞予AngⅡ处理12h建立心肌纤维化模型,再加入相应浓度药物培养一定时间,对照组加入不含AngⅡ和药物的培养基培养,CCK-8法检测CFs细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果与对照组比较,模型组CFs细胞活力明显升高,Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高,细胞凋亡率显著降低(P0.01);与模型组比较,益心泰醇提物低、中、高剂量组CFs细胞活力明显降低,Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低(P0.05,P0.01),益心泰醇提物中、高剂量组细胞凋亡率明显升高(P0.05,P0.01)。结论益心泰醇提物可抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化,其机制可能与抑制CFs增殖、降低细胞活力和Bcl-2蛋白表达、升高Bax蛋白表达、促进CFs凋亡有关。     

基于瞬时受体电位香草素亚家族4信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响

目的:基于瞬时受体电位香草素亚家族4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响。方法:自新生SD大鼠膝关节软骨组织提取软骨细胞,进行体外培养,取第1代软骨细胞分别加入不同培养液进行干预。空白组仅加入常规培养液,牛蒡子苷元组加入含10μmol牛蒡子苷元的培养液,牛蒡子苷元联合阻断剂组加入含10μmol牛蒡子苷元和10μmol GSK205的培养液,激动剂组加入含1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂联合激动剂组加入含10μmol GSK205和1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂组加入含10μmol GSK205的培养液。分别于干预24 h和72 h后以CCK-8法检测软骨细胞增殖情况,48 h后以Western blot法检测软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平。结果:(1)软骨细胞增殖测定结果。干预24 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.03±0.72,1.32±0.11,1.01±0.05,1.33±0.34,1.04±0.50,1.10±0.06;F=18.309,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组、阻断剂组的吸光度与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.632,P=0.840,P=0.164);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.834);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.498);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。干预72 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.66±0.02,2.21±0.05,1.84±0.04,1.92±0.07,1.71±0.10,1.74±0.08;F=37.629,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.001,P=0.000);阻断剂联合激动剂组、阻断剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.326,P=0.104);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组及阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.010),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.098);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。(2)软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平测定结果。5组软骨细胞中软骨蛋白聚糖水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,20.74±5.01,4.20±0.66,22.87±1.82,2.09±0.63;F=194.544,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的软骨蛋白聚糖水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.136,P=0.593);牛蒡子苷元组的软骨蛋白聚糖水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.305);牛蒡子苷元联合阻断剂组的软骨蛋白聚糖水平低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.310);激动剂组的软骨蛋白聚糖水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。5组软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,2.94±0.11,1.92±0.17,2.04±0.12,0.78±0.09;F=58.701,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);阻断剂联合激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平低于空白组(P=0.032);牛蒡子苷元组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000),与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.193);激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。结论:牛蒡子苷元可通过TRPV4信号通路促进体外培养软骨细胞的增殖及软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖的表达。     

反式维甲酸诱导大鼠关节软骨细胞的退变

目的:观察反式维甲酸(TRA)对体外培养大鼠软骨细胞的生长增殖、形态和软骨退变相关基因表达的影响。方法:取出生24hSD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。对照组软骨细胞于体积分数为10%的胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基中进行培养,而TRA组是在对照组培养基的基础上加入10μmolTRA进行培养。培养24h后,观察细胞形态变化,MTT法检测两组细胞的增殖情况,Western Blot检测Ⅱ型胶原和MMP13的表达,DMMB法测定细胞中GAG的含量,定量PCR检测ADAMTS5,MMP9,A-can,Sox9,COLX和ALP的表达。结果:TRA组的软骨形态由原来的多角形变成长梭形,且TRA组抑制软骨细胞的增殖,同时下调基质蛋白Ⅱ型胶原,A-can,GAG含量及转录因子Sox9表达,上调MMP13,MMP9,ADAMTS5,COLX及ALP的表达。结论:TRA具有促进软骨退变的作用,可用于建立体外软骨退变模型。     

丹皮酚与三七总皂苷配伍应用对血管紧张素Ⅱ诱导增殖的心脏成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的:探讨丹皮酚与三七总皂苷配伍应用对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导增殖的心脏成纤维细胞胶原合成的调节作用。方法:选取原代培养的乳鼠心脏成纤维细胞,随机分为6组,分别为空白组,模型组,丹皮酚(45 mg·L~(-1))组,三七总皂苷(50 mg·L~(-1))组,丹皮酚与三七总皂苷配伍的高、低剂量(丹皮酚45,30 mg·L~(-1)+三七总皂苷50,30 mg·L~(-1))组。药物干预48 h,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原的mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达明显升高(P0.01);与模型组比较,AngⅡ可刺激心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的增殖,丹皮酚,三七总皂苷及其配伍的高、低剂量均可抑制Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达(P0.05),其中配伍组的抑制作用较优,且配伍高剂量作用时抑制效果更佳。结论:丹皮酚和三七总皂苷配伍组方可抑制血管紧张素Ⅱ诱导增殖的心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的基因表达,显示明显的协同效应。     

鹿茸多肽对软骨终板细胞基质蛋白及其降解酶基因表达的影响

目的:观察鹿茸多肽对IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞的增殖及基质蛋白(Ⅱ,Ⅹ型胶原)、基质降解酶(金属蛋白酶-13)基因表达的影响。方法:选取1月龄的健康SD大鼠,对其椎间盘软骨终板细胞进行分离与培养,取第3代软骨终板细胞实验,空白对照组不做任何处置,诱导组单加入10μg/L的IL-1β,药物处理组分三组,分别在培养基中加入10μg/L的IL-1β和10μg/mL,30μg/mL,50μg/mL的鹿茸多肽。MTT比色法检测三个时间节点(24h,48h,72h)各组椎间盘软骨终板细胞的增殖情况;qPCR检测法对软骨终板细胞中基质Ⅱ,Ⅹ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13基因的表达情况。结果:在24h,48h,72h时间点,MTT法检测10μg/mL鹿茸多肽组在各时间点软骨终板细胞增殖情况与IL-1β组比较,差异无统计学意义(P0.05);而30μg/mL组和50μg/mL组均能减轻IL-1β对软骨终板细胞増殖的抑制作用,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。qPCR检测结果显示:IL-1β诱导组的Ⅱ型胶原蛋白基因的表达减弱,Ⅹ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13基因的表达增强,与空白组对比差异有统计学意义(P0.05);鹿茸多肽各浓度组均能上升Ⅱ型胶原蛋白基因的表达,下调Ⅹ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13基因的表达水平,差异有统计学意义(P0.05,P0.01),以50μg/mL组效果显著,差异有统计学意义(P0.01)。结论:一定浓度的鹿茸多肽(50μg/mL组)能有效地拮抗IL-1β对软骨终板细胞增殖的抑制作用,上升Ⅱ型胶原蛋白基因的表达,下调Ⅹ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13基因的表达,改善了基质的代谢,起到延缓椎间盘软骨终板退变的作用。     

牛膝醇提物干预BMSC-Exos对OA模型兔局部骨组织超微结构及炎症小体的影响

目的:观察牛膝醇提物含药血清培养的骨髓间充质干细胞来源外泌体对实验兔骨关节炎模型关节局部骨组织超微结构及炎症小体的影响.方法:将20只健康实验兔按照随机数字表法分为空白组、模型组及牛膝醇提物低、中、高剂量组,每组4只,分别予等量蒸馏水及牛膝醇提物低、中、高剂量灌胃1周后采血制备含药血清,用牛膝醇提物不同浓度含药血清连续...     

Effects of puerarin on stiffness in myocardium and expression of collagen type Ⅰand Ⅲ in diastole heart failure rat models

目的 研究葛根素对舒张性心力衰竭(distolic heart failure,DHF)大鼠心肌僵硬度和心肌组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的影响.方法 Wistar大鼠腹主动脉缩窄法建立DHF模型,术后4周,随机分为4组(n=10),模型组,葛根素高、中、低剂量组(180、120、80 mg/kg),另有假手术组10只.连续给予相应处理4周后,通过十六导生理记录仪测量所得的血流动力学指标计算大鼠心肌僵硬度常数(K),并应用免疫组化法测定心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达.结果 与模型组比较,葛根素高剂量组K值无变化(P＞0.05),中剂量组K值显著低于模型组(P＜0.01),低剂量组K值明显低于模型组(P＜0.05).与模型组比较,葛根素高剂量组心肌Ⅰ型胶原蛋白表达明显减弱(P＜0.05),心肌Ⅲ型胶原表达明显增强(P＜0.05):中剂量组心肌Ⅰ型胶原蛋白表达显著减弱(P＜0.01),心肌Ⅲ型胶原蛋白表达显著增强(P＜0.01):低剂量组心肌1型胶原蛋白表达明显减弱(P＜0.05),心肌Ⅲ型胶原表达明显增强(P＜0.05).结论 葛根素中、低剂量能够降低DHF大鼠心肌僵硬度,其作用机制与心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达有关.