内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的 观察内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响.方法 采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁向内皮祖细胞分化.采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定内皮祖细胞,间接免疫荧光检测血管平滑肌细胞标志物平滑肌α-肌动蛋白、钙调节蛋白的表达,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹检测早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的影响.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ(10-6mmol/L)诱导血管平滑肌细胞增殖48 h后,平滑肌α-肌动蛋白mRNA和蛋白表达明显减少,而骨桥蛋白mRNA和蛋白表达明显增加,提示血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化;与血管紧张素Ⅱ组比较,早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液处理后均不同程度抑制血管紧张素Ⅱ诱导的平滑肌α-肌动蛋白表达减少和骨桥蛋白表达增加,其中以早期内皮祖细胞条件培养液的抑制效果最明显.结论 内皮祖细胞能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化.     

低氧诱导因子在低氧中对人外周血内皮祖细胞分化的影响

目的研究低氧诱导因子1α在体外氧化压降低环境中对人外周血内皮祖细胞向血管内皮细胞分化的影响。方法密度梯度离心法分离人外周血内皮祖细胞,电穿孔技术转染低氧诱导因子1α质粒,计算转染效率;逆转录聚合酶链反应测定常氧和低氧环境中低氧诱导因子1α、1β及其血管内皮生长因子mRNA在质粒转染前后表达变化。Westernblot检测转染前后低氧诱导因子1α蛋白表达,流式细胞术测定细胞膜表面抗原决定簇、荧光报告蛋白空质粒或低氧诱导因子1α质粒转染组转后的组间差异,一氧化氮酶法鉴定各组血管内皮生长因子依赖性一氧化氮的释放活性,镜下观察细胞形态及分化程度。结果质粒转染效率约20%;转染20h,低氧诱导因子1αmRNA在常氧中及低氧中均有表达,表达程度与氧浓度无关(P>0.05);低氧及转染低氧诱导因子1α基因诱导血管内皮生长因子表达上调(P<0.05);1β亚基表达在各组中无明显差异(P>0.05)。1%低氧3h低氧诱导因子1α蛋白开始表达,6h时表达成倍增加,12h达高峰,24h表达回到基线水平。流式细胞仪检测发现,转染后常氧下孵育3天,转pEGFP组CD31 细胞占总细胞数40.2%±4.3%,低氧诱导因子1α组占53.8%±3.7%(P<0.05);孵育10天后转pEGFP组CD31 细胞占51.8%±3.5%,低氧诱导因子1α组占66.2%±6.6%(P<0.05)。转染后低氧下孵育3天,转pEGFP组CD31 细胞占总细胞数46.8%±3.5%,低氧诱导因子1α组占60.2%±5.0%(P<0.05);孵育10天,转pEGFP组CD31 细胞占59.0%±3.5%,低氧诱导因子1α组占76.1%±1.9%(P<0.05)。低氧较常氧易促一氧化氮释放,转染低氧诱导因子1α基因使一氧化氮释放增加,释放含量与血管内皮生长因子刺激量成正比,随刺激时间延长而增加(P<0.01)。低氧环境加快内皮祖细胞向内皮细胞分化、扩增,低氧诱导因子1α质粒转染同样促进内皮祖细胞分化。结论低氧诱导因子1α质粒能有效地应用于转录水平进行基因干扰治疗,并在低氧环境中增效,有助于促进内皮祖细胞向内皮细胞分化,为进一步诱导体内血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择。     

基质细胞衍生因子1α对大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移的影响

目的观察基质细胞衍生因子1α对体外培养的大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移的影响。方法微孔法从大鼠骨髓提取内皮祖细胞。免疫荧光鉴定血管内皮生长因子受体2和CD133,不同浓度基质细胞衍生因子1α处理内皮祖细胞后,采用Transwell迁移系统检测内皮祖细胞迁移能力。结果分离出的大鼠骨髓内皮祖细胞免疫荧光下血管内皮生长因子受体2 和CD133 双阳性,基质细胞衍生因子1α呈浓度依赖性促进内皮祖细胞迁移,对照组与基质细胞衍生因子1α各处理组比较差异均具显著性(P<0.05或P<0.01)。结论基质细胞衍生因子1α呈浓度依赖性促大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移。     

降钙素基因相关肽介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化

目的初步探讨内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的分子机制。方法从人脐带血分离、培养、诱导内皮祖细胞分化并鉴定,制备早期内皮祖细胞条件培养基,酶联免疫吸附试验检测降钙素基因相关肽分泌情况。经降钙素基因相关肽抗体预处理内皮祖细胞条件培养基或阻断内皮祖细胞降钙素基因相关肽受体后,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的作用;进一步观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖信号通路(ERK、核因子κB通路)的作用。结果早期内皮祖细胞能够分泌较高浓度的降钙素基因相关肽,并且较晚期内皮祖细胞及脐静脉内皮祖细胞高;内皮祖细胞条件培养基处理能明显抑制血管平滑肌细胞表型转化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的抑制能力明显降低;同时内皮祖细胞条件培养基能够明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的ERK以及核因子κB通路的活化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的ERK、核因子κB信号通路活化的抑制能力明显降低。结论降钙素基因相关肽参与介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞的表型转化,其机制可能与其抑制血管平滑肌细胞ERK、核因子κB信号通路活化有关。     

不同年龄段大鼠血清影响内皮祖细胞向成熟内皮诱导分化

目的观察不同年龄段大鼠血清对骨髓内皮祖细胞向成熟内皮细胞诱导分化的影响。方法无菌取1~2月龄、19~26月龄Sprague-Dawley大鼠股骨和胫骨,获取骨髓单个核细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,经差速贴壁法对二次贴壁细胞在纤维连接蛋白包被的培养板或培养瓶进行体外培养,以DiI-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色和FITC-CD31染色进行鉴定;收集制备相应年龄段(1~2月龄、19~26月龄)大鼠血清,将内皮祖细胞分为老年大鼠内皮祖细胞 老年大鼠血清组、老年大鼠内皮祖细胞 年轻大鼠血清组、年轻大鼠内皮祖细胞 老年大鼠血清组、年轻大鼠内皮祖细胞 年轻大鼠血清组。体外培养的内皮祖细胞经含20%不同年龄段大鼠血清的内皮条件培养基诱导培养后,激光共聚焦显微镜检测DiI-acLDLF、ITC-UEA-1双染色阳性率,免疫组织化学检测假血友病因子表达、逆转录聚合酶链反应分别检测内皮一氧化氮合酶、血管内皮生长因子受体2表达,体外血管生成实验观察内皮祖细胞参与管形生成能力。结果年轻大鼠血清显著提高老年大鼠内皮祖细胞在内皮条件培养基诱导培养后的DiI-acLDLF、ITC-UEA-1双染色阳性率(P<0.05),而老年大鼠血清显著降低年轻大鼠内皮祖细胞双染阳性率(P<0.05);年轻大鼠血清明显促进老年大鼠内皮祖细胞在内皮条件培养基诱导培养后的血管性血友病因子、内皮型一氧化氮合酶(P<0.01)及血管内皮生长因子受体2表达(P<0.05);年轻大鼠血清显著减少内皮条件培养基诱导培养后未参与血管生成的老年大鼠内皮祖细胞数(P<0.05)。结论年轻大鼠血清可显著增强老年大鼠内皮祖细胞向内皮细胞诱导分化的能力,而老年大鼠血清可部分抑制年轻大鼠内皮祖细胞向成熟内皮细胞诱导分化;年轻大鼠血清中可能存在激发衰老个体内皮祖细胞活力的系统性血清因子,这些因子可增强衰老个体来源的内皮祖细胞内在分化潜能。     

微小RNA-126抑制间质转化中内皮祖细胞的增殖与迁移

目的探讨微小RNA-126(mi R-126)对间质转化中的血管内皮祖细胞(EPC)增殖与迁移的影响。方法分离大鼠骨髓源内皮祖细胞,转化生长因子β1(TGF-β1)诱导EPC的间质转化,慢病毒转染建立mi R-126过表达EPC,通过MMT法检测EPC的增殖,细胞划痕实验与Transwell法检测细胞迁移能力。结果 TGF-β1成功诱导EPC间质转化,mi R-126抑制间质转化中EPC损伤细胞间距的缩短,抑制Transwell小室膜下单位面积的细胞数量。结论 mi R-126过表达抑制间质转化中EPC的增殖与迁移。     

骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定

目的 研究分离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进行诱导分化鉴定,为临床进行缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础.方法 用灌注法分离小鼠骨髓血管内皮祖细胞,用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化,形态学观察细胞的生长过程,并利用抗CD34抗体鉴定血管内皮祖细胞,利用抗vWF抗体、抗eNOS抗体鉴定血管内皮细胞. 结果小鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长,可诱导分化为表达特异性组织蛋白的内皮细胞.结论 在小鼠骨髓内可分离出骨髓源性血管内皮祖细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力.     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对大鼠内皮祖细胞功能活性的影响

目的研究粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对内皮祖细胞功能活性的影响,为探讨血管内皮再生修复机制和心血管疾病的防治提供实验基础。方法首先用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓和脾内皮祖细胞,在倒置相差显微镜下观察内皮祖细胞的生长分化过程。标记FITC-AC133和PE-vWF鉴定内皮祖细胞,在荧光显微镜下观察。然后选取培养7d的内皮祖细胞施加实验因素。分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的体外模型检测粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对内皮祖细胞增殖、迁移、管腔形成能力的影响。结果与对照组相比,粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子作用后,内皮祖细胞的OD490值、迁移的细胞数和形成的管腔数显著增加(P<0.001),且随着作用浓度的增加和作用时间的延长内皮祖细胞的OD490值、迁移的细胞数和形成的管腔数逐渐增加。结论在体外,粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子能够增强内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,并随着作用浓度的增加和作用时间的延长其效应增强。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮祖细胞增殖、凋亡及bcl-2表达的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮祖细胞增殖、凋亡及bcl-2表达的影响。方法密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度氧化型低密度脂蛋白(分别为5、10及20mg/L)干预48h。MTT法检测氧化型低密度脂蛋白对内皮祖细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测氧化型低密度脂蛋白对细胞凋亡率的影响,逆转录聚台酶链反应检测bcl-2mRNA的表达,免疫细胞化学法检测bcl-2蛋白的表达。结果氧化型低密度脂蛋白呈浓度依赖性抑制内皮祖细胞增殖,诱导内皮祖细胞凋亡(P<0.01);基础状态下内皮祖细胞表达bcl-2mRNA及蛋白,氧化型低密度脂蛋白处理能抑制其表达,并存在量效关系(P<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白通过下调bcl-2的表达诱导内皮祖细胞凋亡、抑制内皮祖细胞增殖,这可能影响血管内皮的修复及新生血管的形成。     

人外周血、脐血、脂肪组织来源的内皮祖细胞部分生物学特性比较

目的研究人外周血、脐血和脂肪组织三种不同来源内皮祖细胞部分生物学特性异同,探讨其可能不同的适应范围和方式及方法,进而为提高内皮祖细胞的应用效率提供依据。方法采用密度梯度离心法分离人外周血、脐血单个核细胞,胰蛋白酶消化提取脂肪组织干细胞。所采集细胞诱导分化,观察细胞形态,对培养第7天的细胞进行鉴定。采用MTT法检测细胞增殖,Boyden小室检测细胞迁移能力,贴壁法检测细胞黏附功能以及血管生成试剂盒检测细胞体外成血管能力。结果诱导分化细胞均证实为内皮祖细胞。脐血源性内皮祖细胞增殖、迁移、黏附、成血管能力最强(P<0.05)。脂肪组织来源内皮祖细胞增殖与成血管能力方面较外周血来源内皮祖细胞强(P<0.05)。结论人脐血内皮祖细胞可能更适用于同种异体干细胞移植,脂肪组织来源内皮祖细胞可能在自体干细胞移植治疗缺血性疾病方面有潜在应用前景。     

内皮祖细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 研究内皮祖细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞增殖的影响及机制。方法 从人脐带血分离、培养、诱导内皮祖细胞分化并鉴定,分别制备早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液,采用BrdU标记法、蛋白定量、MTT以及流式细胞术分析早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率以及细胞周期进程的影响;进一步采用Western blot观察早期内皮祖细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞MAPK （p38、JNK、ERK活化）信号通路以及原癌基因c-myc、c-fos表达的影响。结果 血管紧张素Ⅱ（10^-6 mmol/L）诱导血管平滑肌细胞增殖48 h后,血管平滑肌细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组明显增加,细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著增加,G₁期细胞所占百分率均相应较对照组减少;p38、JNK、ERK活化以及c-myc、c-fos的表达均较对照组显著增加;而早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液处理后能够显著抑制血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率的增加以及阻滞血管平滑肌细胞从G₁期向S期的转化;同样早期内皮祖细胞条件培养液也抑制了血管紧张素Ⅱ所致p38、JNK、ERK的活化以及c-myc、c-fos的表达,其中均以早期内皮祖细胞条件培养液的抑制效果最明显。结论 内皮祖细胞能够抑制血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞增殖,其机制可能与其抑制MAPK信号转导通路的活化以及原癌基因c-myc、c-fos的表达有关。     

人脐静脉血内皮祖细胞的分离扩增和生物学特征

目的:探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离和扩增条件,并观测其生物学特性.方法:采集人脐静脉血,应用密度梯度离心法,分离其中单个核细胞,流式细胞术检测CD133 CD34 阳性率;利用差速贴壁法(48 h内贴壁和48 h后贴壁)联合内皮细胞专用培养基EGM-2培养细胞,接种于预先包埋了明胶培养瓶或培养板,倒置显微镜观察细胞生长形态和形成集落能力,免疫细胞化学法检测其免疫表型,摄取Ac-LDL和连接UEA-1功能,在生长因子培养体系中诱导其向成熟内皮细胞分化.结果:所获单个核细胞中CD133 CD34 百分比为1.06%;在EGM-2培养体系下可获得2种亚型的内皮祖细胞,即早期内皮祖细胞和晚期增殖性内皮祖细胞.其中48h后贴壁细胞属于早期内皮祖细胞,增殖能力较弱,免疫荧光检测,显示CD14和CD34KDR胞浆呈阳性表达,Ac-LDL UEA-1 功能特征;而48 h内贴壁细胞在10～17 d时可见由单个细胞增殖形成的克隆,呈铺路石样单层排列,增殖力旺盛形成融合状态,形成次集集落;经免疫荧光检测,显示CD133CD34和CD34KDR细胞质呈阳性表达,Ae-LDL UEA-1 功能特征,传代后vWF,CD31呈强阳性表达,是晚期增殖性内皮祖细胞.结论:经人脐静脉血可分离培养获得2种亚型的内皮祖细胞,在特定的培养体系中细胞可由祖细胞表型向成熟内皮细胞分化.     

静脉注射携带缺氧诱导因子的内皮祖细胞对裸鼠缺血下肢血管新生的作用

目的探讨静脉注射携带缺氧诱导因子1α的内皮祖细胞对裸鼠缺血下肢血管新生的作用及机制。方法在体外将腺病毒介导人缺氧诱导因子1α基因入人外周血内皮祖细胞,观察转染后的内皮祖细胞在裸鼠缺血下肢局部的促血管新生作用,并探讨其可能的作用机制。结果转染腺病毒—缺氧诱导因子1α后的内皮祖细胞在细胞内有效并持续表达;移植异种腺病毒—缺氧诱导因子1α内皮祖细胞至Balb/c鼠缺血下肢后可见外源性内皮祖细胞定向作用于缺血部位;移植腺病毒—缺氧诱导因子1α内皮祖细胞组较对照组明显促进体内毛细血管数目增加(P<0.05);mRNA检测提示过表达缺氧诱导因子1α基因可上调其下游的基质细胞衍生因子、CXCR4因子(P<0.05),增加内皮祖细胞招募,同时促血管内皮生长因子水平上调(P<0.05)。结论在体内,转染腺病毒—缺氧诱导因子1α的内皮祖细胞可促进缺血下肢的局部血管新生,这种内皮祖细胞数量的增加可能与基质细胞衍生因子、CXCR4的招募及血管内皮生长因子的分泌增加有关。     

糖基化终产物引起晚期内皮祖细胞功能障碍

目的观察与糖尿病患者血清浓度类似的糖基化终产物修饰的牛血清白蛋白对体外培养脐血来源晚期内皮祖细胞功能的影响并探讨可能机制。方法密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,用差速贴壁法分离、培养晚期内皮祖细胞。流式细胞术、免疫细胞化学染色及荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白、植物凝集素被用于鉴定培养的细胞。将晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白与晚期内皮祖细胞共同培养24h后,利用噻唑蓝法检测细胞的增殖能力,AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;Boyden小室法检测血管内皮生长因子趋化的细胞迁移;ECMatirx-gel检测形成毛细血管样网状结构的能力。利用逆转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法测定糖基化终产物受体mRNA和蛋白表达水平。结果脐血单个核细胞在体外培养过程中先后出现两种细胞:第5～7天出现集落样生长细胞,扩增不明显,存在14天左右即消失,这类细胞被称为"早期内皮祖细胞";10～15天时,逐渐出现20～50个细胞组成的细胞簇,1～3天即可形成大于500个细胞簇,细胞呈铺路石样,可传代,大于95%的细胞免疫表型为CD45-/CD146+/CD105+,表达内皮细胞特有的vWF因子,可摄取乙酰化低密度脂蛋白并可与荆豆凝集素1结合,这类细胞被称为"晚期内皮祖细胞"。50～400mg/L晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白与晚期内皮祖细胞共培养24h后,与对照组相比,细胞的增殖能力未见明显变化(P0.05)。当晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白浓度大于100mg/L时,与对照组相比,晚期内皮祖细胞的凋亡增加(P0.05)、血管内皮生长因子趋化的迁移以及在ECMatirx-gel上形成新生血管的能力下降(P0.05),糖基化终产物受体mRNA和蛋白表达均增加(P0.05)。结论糖基化终产物通过促进凋亡、抑制迁移及体外形成新生血管的能力引起晚期内皮祖细胞功能障碍,这些影响可能与糖基化终产物上调晚期内皮祖细胞上糖基化终产物受体表达有关。     

美乐托宁对冠心病患者循环血中内皮祖细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨抗氧化剂美乐托宁对冠心病患者循环血中内皮祖细胞增殖与凋亡的影响及其机制.方法 选择冠状动脉造影确定冠心病患者36例,密度梯度离心法获取冠心病患者外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度美乐托宁(0.5、1.0和2.0 mmol/L)干预6、12、24和48 h.MTT法检测美乐托宁对内皮祖细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测美乐托宁对细胞凋亡率的影响,逆转录.聚台酶链式反应技术检测Bcl-2mRNA表达,Western blot检测Bcl-2的蛋白表达.结果 美乐托宁呈浓度和时间依赖性改善体外培养的冠心病患者外周血内皮祖细胞的粘附、迁移和增殖能力(P<0.01);美乐托宁抑制体外培养的冠心病患者外周血中内皮祖细胞的凋亡,作用呈浓度和时间依赖性(P<0.01);美乐托宁上调内皮祖细胞内Bcl-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).结论 美乐托宁能改善体外培养的冠心病患者外周血内皮祖细胞的粘附、迁移和增殖能力,并通过上调凋亡抑制基因Bcl-2而发挥抑制内皮祖细胞凋亡的作用.     

葡萄糖对不同氧浓度下内皮祖细胞表达低氧诱导因子-1α的影响

目的 观察葡萄糖对低氧（1%氧浓度）和常氧（21%氧浓度）状态下内皮祖细胞表达低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的影响,探讨低氧在糖尿病周围血管病发生中的可能作用.方法 常规培养健康人外周血来源的内皮祖细胞,加入不同浓度葡萄糖（5、10、33 mmol/L）分为A、B、C 3组,并在常氧和低氧条件下分别进行培养.实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测内皮祖细胞表达HIF-1α及VEGF的水平,免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达,ELISA法检测VEGF分泌水平.结果 （1）低氧组表达HIF-1α mRNA（A、B和C组分别为1.25±0.34、1.35±0.26和0.75±0.22）高于常氧组（A、B和C组分别为1.03 ±0.25、1.21±0.28和0.61±0.17）,差异具有统计学意义（A、B和C组t值分别为1.96,2.11,1.89,均P＜0.05）;而在相同氧浓度下,B组的内皮祖细胞表达HIF-1α mRNA高于A组和C组,差异具有统计学意义（低氧组F=23.54,P＜0.01;常氧组F=29.46,P＜0.01）.（2）在相同葡萄糖浓度下,低氧组和常氧组VEGF的蛋白表达差异无统计学意义（t值分别为0.933、1.258和1.001,均P＞0.05）.在低氧浓度下,VEGF的蛋白表达A、B和C组分别为2953±237、2473±205和1768±195,差异具有统计学意义（F=137.43,P=0.000）;在常氧浓度下,A、B和C组VEGF蛋白分别为2868±247、2377±197和1844±203,F=97.96,P=0.000.结论 高糖对低氧条件下的内皮祖细胞具有毒性作用,能减弱其表达HIF-1α和VEGF,可能在糖尿病周围血管病的发生中发挥一定作用.     

C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响

目的研究C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成及其功能活性的影响,探讨C反应蛋白在动脉粥样硬化病变发展中的可能作用机制。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓内皮祖细胞,并用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的植物凝集素双染,在共聚焦显微镜下观察。将细胞与不同浓度C反应蛋白(0、1、5及10 mg/L)共同培养,建立内皮祖细胞与大鼠心脏微血管内皮细胞共同培养的体外血管形成模型。分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel检测C反应蛋白对内皮祖细胞增殖活性、迁移及管腔形成能力的影响。用Western blotting分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2和内源性血管内皮生长因子的表达。结果随着浓度的增加,C反应蛋白明显减少内皮祖细胞掺入模型中心脏微血管内皮细胞管腔结构的数量,减弱内皮祖细胞的增殖活性,减少迁移的细胞数及形成的管腔数,上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白、整合素β2、内源性血管内皮生长因子的表达。结论 C反应蛋白减弱了内皮祖细胞参与血管形成的能力,这与其抑制内皮祖细胞的功能活性有关,从而可能促进了动脉粥样硬化等缺血性疾病的发展。     

高血压对内皮祖细胞再内皮化能力的影响

目的:探讨高血压对内皮祖细胞粘附、迁移功能及再内皮化能力的影响.方法:选择初发的原发性高血压患者和性别、年龄匹配的健康志愿者各10例,分离其外周血的单个核细胞诱导分化成内皮祖细胞,并通过免疫荧光标记等方法进行形态学观察和鉴定.培养7天后分别观察2组内皮祖细胞的粘附和迁移能力.建立裸鼠颈动脉内皮损伤模型,分别移植健康志愿...     

缓激肽对内皮祖细胞存活、迁移及凋亡的影响

目的 观察不同浓度的缓激肽对人脐血来源的内皮祖细胞存活、迁移及凋亡的影响。方法 采用密度梯度离心法从人脐带血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养7天后,收集贴壁细胞。通过免疫荧光法鉴定,FITC标记的异凝集素和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白染色双染色阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,并经流式细胞仪检测技术进一步确定内皮祖细胞。以不同浓度缓激肽（1、10、100 nmol/L）或缓激肽B2受体阻断剂艾替班特+ 10 nmol/L 缓激肽干预内皮祖细胞 16 h。分别采用MTT比色法、Transwell小室和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶流式细胞术及Hoechst33342染色法观察缓激肽对人内皮祖细胞的存活、迁移以及凋亡影响。 结果 缓激肽在1、10 nmol/L浓度时可促进人内皮祖细胞存活、迁移,抑制其凋亡（P<0.05）。然而100 nmol/L缓激肽无促人内皮祖细胞存活、迁移和抑制其凋亡的作用（P>0.05）。缓激肽促人内皮祖细胞存活、迁移,抑制其凋亡的作用可被艾替班特阻断（P<0.05）。 结论 缓激肽在一定范围内可促进内皮祖细胞的存活、迁移,并抑制其凋亡,此作用主要由缓激肽B2受体介导。     

过表达Jagged1促老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移

目的 探讨过表达Jagged1对老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力的影响.方法 PBS冲洗1～2月龄和19～ 26月龄SD大鼠股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用含10％ FBS的DMEM/F12培养基差速贴壁法进行体外培养,以Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染和vWF免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为四组:对照组(未进行基因转染的老龄大鼠内皮祖细胞组)、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源内皮祖细胞组.荧光显微镜下计数GFP表达细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测Jagged1 mRNA和蛋白表达;Transwell培养和MTT法分别检测细胞迁移和增殖能力.结果 免疫组织化学、RT-PCR和Western blot检测均显示转染后Jagged1显著增高,PIRES2-EGFP-Jagged1转染组mRNA和蛋白表达均较对照组显著增强(P＜0.01);与对照组相比,过表达Jagged1显著增强老龄大鼠来源内皮祖细胞迁移和增殖能力(P ＜0.05或P＜0.01).结论 过表达Jagged1增强老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力.