黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

β-淀粉酶的表达与酶学性质

本研究在构建重组表达质粒p PIC-BBA的基础上,构建并筛选获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-BBA。重组酵母在摇瓶发酵条件下,能够分泌表达180 U/m L的β-淀粉酶酶活力。进一步对该重组酶的酶学性质进行了分析,重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃,最适作用p H值为5.0,在不高于55℃和在p H 3.0~10.0之间有良好的热稳定性和p H值稳定性。重组酶水解淀粉的主要产物为麦芽糖,在普鲁兰酶的协助下,其水解淀粉形成麦芽糖的最大转化率为78.28%。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

重组嗜热乳糖酶在毕赤酵母中的表达、纯化与活性分析

为获得耐高温的重组乳糖酶,PCR扩增激烈热球菌(Pyrococcus furious)乳糖酶基因、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/Lac并转化毕赤酵母X-33菌株。重组酵母转化子经甲醇诱导,重组嗜热乳糖酶实现了分泌表达并经蛋白印迹验证。纯化前上清液中乳糖酶总活力高达125 U/mL,经镍亲合纯化得重组酶,SDS-PAGE显示其纯度在95%以上,比活力1 800 U/mg,该酶最适温度在105℃左右且热稳定性好,具有很强的水解乳糖能力。     

一种酸性真菌α-淀粉酶的异源表达与重组酶性质

用PCR方法扩增扣囊复膜孢酵母CICIM Y1037菌株真菌α-淀粉酶基因成熟肽编码区(SfA),插入表达载体pPIC9K。重组质粒pPIC9K-SfA转化巴斯德毕赤酵母GS115,筛选获得淀粉酶活力相对最高的重组菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-SfAmy LZ08。SDS-PAGE电泳分析纯化获得的重组酶SfA,结果显示重组酶分子质量为61 kDa左右。SfA最适反应温度为45℃、最适pH为4.5,是一种酸性α-淀粉酶。Ca2+对SfA的热稳定性有促进作用,重组酶在含5 mmol/L Ca2+,pH 4.5的溶液中,55℃保温4 h酶活仍保留80%以上。SfA水解玉米淀粉获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖和麦芽三糖为主要产物,分别占水解物的37%和39%。重组酶SfA在麦芽三糖和麦芽寡糖糖浆生产中有一定的应用潜力。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母中的高效表达及其催化合成维生素E醋酸酯

本研究将经密码子优化的皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase) CRL1基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHKA,构建得到重组菌株GS115/pHKA-CRL1;经摇瓶发酵并结合甲醇诱导120 h处理,该菌株对底物对硝基苯酚丁酯(p NPB)的水解活力达到39.73 U/mL。通过对AOX1启动子和α分泌信号肽同时进行改造,进一步获得重组菌株GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1,其脂肪酶活力提高达到63.63 U/mL。发酵液上清液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀后,再经脱盐和阴离子交换层析处理,获得纯化的重组CRL1。该纯化工艺的纯化倍数为5.41倍,回收率为33.81%。而纯化重组CRL1的比酶活为984.5U/mg。重组CRL1的最适温度为40℃,最适pH为7.5;经40℃保温6 h,仍保留52.99%的相对活力;在偏酸性环境中较为稳定。以摇瓶发酵、真空冷冻干燥后的重组CRL1为催化剂,在无溶剂体系中催化合成维生素E醋酸酯,在最适反应条件下(200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、100 mg CRL1、反应温度60℃、转速200 r/min、反应时间9 h),D-α-生育酚的转化率在97.00%以上。     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃,比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。     

雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究

采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达,重组菌株摇瓶培养144 h后,酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5,最适反应温度为35℃。1 mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20,吐温80,曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯(C12)。     

木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

黑曲霉单宁酶基因在毕赤酵母中的表达

单宁酶(EC3.1.1.20)在食品、化工及医药等领域应用广泛,期望通过单宁酶在毕赤酵母中的表达来提高单宁酶的产量。以经室温常压等离子体诱变技术诱变得到的较高产单宁酶的黑曲霉B1401的总DNA为模板,PCR扩增获得单宁酶基因(tan)后构建重组表达载体pPIC9K-tan,通过电转化至毕赤酵母GS115,利用甲醇诱导培养重组菌获得单宁酶。单宁酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为5.0,最高酶活力可达到34.25 U/g,相较于黑曲霉B1401产单宁酶活力提高了1.38倍,Ca~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)等金属离子对重组单宁酶酶活力影响不大。实验结果表明实现了单宁酶在毕赤酵母中的高效表达。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析

通过RT-PCR克隆、鉴定了黑曲霉中编码1种葡聚糖酶基因eglA6,所编码的重组酶蛋白命名为AneglA6。通过密码子优化提高了AneglA6在巴斯德毕赤酵母中的表达水平,对重组酶进行纯化并研究酶学性质,重组酶表观分子量约为52 ku。以大麦葡聚糖为底物时,重组酶比酶活为12 450. 6 U/mg;以CMC-Na为底物时,酶活是1 645. 7 U/mg;以酵母葡聚糖等β-1,3-葡聚糖为底物时,重组酶未表现出明显的活力。重组酶最适温度为75℃,在75℃和70℃下半衰期分别为1. 9和4. 6 h。AneglA6最适pH为4. 0,在pH 3. 0～5. 5范围内具有酶活力的50%以上。AneglA6是一种在酸性和高温条件下有较高活力和稳定性的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶。     

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。