基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法，比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化。 方法：实验于2004-07／2005-06在南方医院检验医学中心完成。①取C57B／L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞。将培养的树突状细胞分成两组，未成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4诱导)；成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4+脂多糖)，每天光镜观察各组细胞生长情况。第6天收集细胞，其形态采用电镜观察。②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析。③取BALB／c小鼠脾脏细胞，分离T细胞作为反应细胞。用两组树突状细胞作为刺激细胞。按刺激细胞与反应细胞1∶5，1∶10，1∶20，1∶40的比例混合培养，并用T细胞悬液作阴性对照，观察混合淋巴细胞反应情况。 结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形，少量菌幕样突起；脂多糖刺激后，树突状细胞呈悬浮状态，表面较多细长突起。②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺；成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起。透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则，突起较少，胞浆内有许多吞饮泡及多泡体；成熟树突状细胞形态不规则，胞内囊泡结构减少，细胞器较丰富，细胞核偏向一侧，表面有细长树枝状突起。③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，低水平表达CD40，CD86和CD25；成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，高水平表达共刺激分子。④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖；成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖。 结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞，低表达共刺激分子，体外诱导同种T细胞增殖能力较弱，呈现耐受性树突状细胞特性，有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗。     

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景:沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞? 目的:探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响.方法:利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelB shRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察.结果:体外培养第 6 天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P < 0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P < 0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似.说明RelB shRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟.     

小鼠脾脏树突状细胞的体外扩增与培养

背景:脾脏来源的树突状细胞诱导周期长,产量相对较少,相关报道亦较少.目的:建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞的方法.设计、时间及地点:细胞形态学观察实验,于2007-02/09在华北石油总医院中心实验室完成.材料:健康BALB/C小鼠、C57小鼠及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4.方法:无菌手术取C57小鼠脾脏,用1 mL注射器抽取Hanks液,刺入脾脏并反复冲洗,获取单个核细胞,用0.1 g/L粒-单核细胞集落刺激因了、白细胞介素4的H-DMEM培养,8 d后即得成熟的树突状细胞.同时无菌取BABIJC小鼠脾脏制备单细胞悬液,收集非黏附细胞调整密度后作为反应细胞.再将两种细胞混合培养.主要观察指标:成熟树突状细胞的形态学观察,并对其表面CD11c,CD86及MHC-Ⅱ类分子进行检测.并计算两种细胞混合培养后的吸光度值.结果:体外诱导培养8 d后获得大量成熟的树突状细胞,细胞表面具有典型的树枝状突起,高表达树突状细胞相对特异性表面分子CD11c(78.46%)、CD86(87.24%)及MHC-Ⅱ(92.65%),同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖的能力.结论:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素体外诱导培养小鼠脾脏细胞,可生成大量功能成熟的树突状细胞.     

未成熟树突状细胞表面CD1d分子在体外移植免疫中的作用

背景：树突状细胞具有双向免疫调节作用,成熟树突状细胞激活免疫应答,而未成熟树突状细胞则倾向诱导免疫耐受。目的：探讨鼠CD1d分子在未成熟树突状细胞诱导移植免疫耐受中的作用,以及在此过程中细胞因子的参与机制。方法：利用vIL-10转染的BALB/c小鼠未成熟树突状细胞在体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因、脂多糖刺激成熟,经抗CD1d（anti-CD1d）干预。观察培养后的细胞表型、细胞因子表达。为探明CD1d分子在异体T细胞存在下的免疫作用,进行不同实验条件的初次、再次混合淋巴细胞培养（1stMLC、2ndMLC）,观察T细胞增殖、细胞因子表达。结果与结论：Anti-CD1d的干预降低了未成熟树突状细胞增殖异体T细胞的能力,anti-CD1d干预的未成熟树突状细胞致敏异体T细胞后其免疫功能低下;anti-CD1d干预在异体T细胞存在时影响未成熟树突状细胞在功能上的成熟,主要表现在抑制白细胞介素12的分泌,加强白细胞介素10的分泌。     

未成熟树突状细胞表面CD1d分子在体外移植免疫中的作用

背景:树突状细胞具有双向免疫调节作用,成熟树突状细胞激活免疫应答,而未成熟树突状细胞则倾向诱导免疫耐受。目的:探讨鼠CD1d分子在未成熟树突状细胞诱导移植免疫耐受中的作用,以及在此过程中细胞因子的参与机制。方法:利用vIL-10转染的BALB/c小鼠未成熟树突状细胞在体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因、脂多糖刺激成熟,经抗CD1d(anti-CD1d)干预。观察培养后的细胞表型、细胞因子表达。为探明CD1d分子在异体T细胞存在下的免疫作用,进行不同实验条件的初次、再次混合淋巴细胞培养(1stMLC、2ndMLC),观察T细胞增殖、细胞因子表达。结果与结论:Anti-CD1d的干预降低了未成熟树突状细胞增殖异体T细胞的能力,anti-CD1d干预的未成熟树突状细胞致敏异体T细胞后其免疫功能低下;anti-CD1d干预在异体T细胞存在时影响未成熟树突状细胞在功能上的成熟,主要表现在抑制白细胞介素12的分泌,加强白细胞介素10的分泌。     

小鼠髓系树突状细胞的体外扩增和超微结构

背景:树突状细胞可激发初始型T细胞,是目前所知机体功能最强的专职抗原递呈细胞,但对其超微结构的研究鲜见报道.目的:观察小鼠髓系树突状细胞不同发育阶段以及CD40配基化和肿瘤坏死因子α刺激后树突状细胞的超微结构特征.方法:无菌取小鼠骨髓前体细胞,采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4联合方案体外诱导获得未成熟树突状细胞,负载早期凋亡的肿瘤细胞后采用小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α刺激48 h,按常规方法制备超薄切片,透射电镜观察树突状细胞的超微结构特征.结果与结论:前体细胞及未成熟树突状细胞内有清晰可见的吞饮泡,未成熟树突状细胞的胞质内可见"C"形和环形溶酶体;凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞可见凋亡小体被吞噬或包裹的现象,小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α均可促进树突状细胞成熟,但肿瘤坏死因子α作用后,部分树突状细胞有自噬和凋亡改变.结果提示,小鼠骨髓来源树突状细胞在不同分化发育阶段有其特殊的超微结构表现,肿瘤坏死因子α可介导树突状细胞发生自噬和凋亡.     

腺相关病毒介导癌胚抗原转染树突状细胞对免疫功能的调节作用

目的:近年来,树突状细胞参与调节作用的研究较多。实验拟验证重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原基因转染树突状细胞后其的免疫调节作用的变化。方法:实验于2006-06/2006-11在美国阿肯色大学医学院基因治疗中心完成。①实验方法:取健康人外周血(自愿捐献),采用改良Ficoll密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞,取贴壁细胞,分为rAAV/CEA转染组和空白对照组,均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子-α诱导树突状细胞前体细胞成熟,将成熟树突状细胞与末梢血淋巴细胞按比例混合培养,可得到激活的细胞毒性T淋巴细胞。②实验评估:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志表达,细胞毒性T淋巴细胞的免疫表型变化,细胞毒性T淋巴细胞γ-干扰素表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测树突状细胞的白细胞介素12和白细胞介素10表达。结果:①rAAV/CEA转染树突状细胞的CD14较空白对照组降低,共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86表达均较空白对照组高。②成熟树突状细胞细胞因子表达中,rAAV/CEA转染组的白细胞介素12较空白对照组升高,白细胞介素10降低。③与空白对照组比较,rAAV/CEA转染组能高表达CD8 T细胞和其表型CD69,CD8/CD56的T细胞比例上调,CD25 CD4 的T细胞减少。④rAAV/CEA转染的细胞毒性T淋巴细胞表达相对较高水平的γ-干扰素,与杀伤实验结果相吻合。结论:rAAV/CEA转染树突状细胞能够激活细胞毒性T淋巴细胞的特异性杀伤作用,与树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面标志变化和细胞内细胞因子水平变化相关。     

当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响

目的:探讨当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响。方法:取当归多糖处理和未处理的转基因小鼠脾脏来源的单个核细胞,以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素-4培养诱导树突状细胞,显微镜下观察其形态,流式细胞仪检测其表面共刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平等方法进行研究。结果:当归多糖处理组小鼠树突状细胞的表面协同刺激分子(CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均高于对照组(P<0.05)。结论:当归多糖可以促进乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞的成熟,上调其表面协同刺激分子CD86的表达,增强了其促淋巴细胞细胞增殖和分泌IL-12、r-IFN的能力,加强其抗原递呈能力,诱导细胞免疫反应,在乙肝病毒转基因小鼠抗病毒免疫中可能发挥一定的作用。     

小鼠骨髓树突状细胞的培养扩增及生物学特性分析

背景:树突状细胞是目前已知功能最强的专职性抗原递呈细胞,但树突状细胞在体内分布广泛且数量较少,获得大量的树突状细胞是研究树突状细胞特性和功能的前提。目的:建立小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法,观察其形态和相关特征。设计、时间及地点:树突状细胞形态学观察实验,于2006-08/2007-05在中山大学中山眼科中心实验室完成。材料:健康雌性C57BL/6小鼠。方法:在无菌条件下提取C57BL/6鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4协同诱导下培养,加用磷酸脂多糖刺激,分成磷酸酯多糖-树突状细胞和单纯树突状细胞组,前者在培养加入磷酸酯多糖,后者不加。主要观察指标:应用光镜和电镜下观察树突状细胞的形态,流色细胞仪检测鉴定其生物学特征。结果:体外培养2周后具有典型的树突状细胞形态,光镜下显示细胞表面不规则,呈树突状突起,电镜下可见培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征,流式细胞鉴定为髓系树突状细胞,高表达MHCII类分子及共刺激分子(MHCII,CD80,CD83,CD11c)。单纯树突状细胞组的细胞中度表达MHCⅡ类分子,低水平表达共刺激分子,刺激T细胞增殖的能力较弱;...     

小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,为免疫耐受研究提供实验材料和奠定基础。方法在无菌条件下提取ICR小鼠脾脏淋巴细胞和骨髓细胞,以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,光镜下观察DC的形态,流式细胞仪检测CD80、CD86表达水平。结果骨髓细胞体外诱导培养3天后,光镜下显示细胞表面不规则,呈树突状突起,可见典型的树突状细胞形态,低表达共刺激分子(CD80,CD86)。结论与脾脏细胞相比,骨髓细胞中不仅富含大量的DC的前体细胞而且诱导成DC时间短。