肝癌热休克蛋白—抗原肽复合物的构建及诱导CTL反应的初步研究

目的：研究体外构建热休克蛋白-抗原肽复合的方法,观察其在体外的抗肿瘤作用。方法：用经43℃热处理1小时的人肝细胞悬液,经过裂解液裂解,60%-80%饱和硫酸铵沉淀,用SephadexG-100柱制备,取分子量为70KD组份,Westen blot进行性质鉴定。应用多肽解离液处理该组份,SephadexG-25柱过滤获得未结合多肽的蛋白分子,使其在体外与肝癌抗原肽SLIVHLNEV结合,构建成热休克蛋白-抗原肽复合物。应用此复合物树突状细胞,激活同源外周血T淋巴细胞产生肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞（CTL）,应用MTT法检测其对T2细胞及肿瘤细胞的杀伤活性。结果：所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定为热休克蛋白70。SephadexG-25柱双分离法证实应用上述方法成功构建了肝癌热休克蛋白70-抗原肽复合物,用该复合物负荷树突状细胞在体外可以诱导出较强的肝癌抗原肽物特异性CTL,可以杀伤负荷有该肽的T2细胞及递呈该肽的肿瘤细胞系。结论：体外构建的热休克蛋白-抗原肽复合物可以增强抗原肽诱导CTL反应能力,热休克蛋白是良好的T细胞免疫佐剂,有可能在肿瘤疫苗治疗中发挥重要作用。     

FBL-3肿瘤抗原的研究:Ⅱ.从多肽池中分析肿瘤抗原

在抗肿瘤免疫效应中细胞毒T淋巴细胞(CTL)是通过识别肿瘤细胞MHC I类分子结合的肿瘤源性多肽.为分析肿瘤细胞的抗原性及肿瘤抗原的多肽性质,本文选用FBL-3肿瘤细胞,用pH3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液间隔24～36小时多次酸洗肿瘤细胞,以获得MHC I类分子结合的多肽,并分析酸洗液中多肽混合物的肿瘤抗原性,以及RP-HPLC分离的部分收集液多肽的肿瘤抗原性,为FBL-3肿瘤细胞抗原的确定提供基本数据.结果表明:酸洗法能有效获得肿瘤细胞MHC I类分子相关的多肽抗原,肿瘤细胞多肽抗原的分离、纯化、HPLC分析以及抗原性鉴定是肿瘤抗原性确定的一个重要方法.     

热休克蛋白70与肿瘤细胞凋亡

热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是热休克蛋白家族中重要成员之一.它作为"分子伴侣",在细胞生长过程中与许多促凋亡和抗凋亡分子相互作用,调节其靶蛋白的活性和功能,因此与细胞凋亡有着密切联系.本文仅就HSP70与肿瘤细胞凋亡相关性的最新研究进展作一综述.     

细胞外HSP70与肿瘤的研究现状

目的：探讨细胞外热休克蛋白70（heatshock protein 70。HSP70）的释放、功能、免疫学机制以及在肿瘤免疫治疗中的应用。方法：应用Medline、PubMed及CNKI期刊全文数据库检索系统．以“细胞外热休克蛋白70的释放、肿瘤免疫、应用”为关键词,检索2002—2013年的相关文献。纳入标准：1）细胞外热休克蛋白的功能;2）细胞外热休克蛋白的释放机制;3）细胞外热休克蛋白与肿瘤免疫。根据纳入标准符合分析的文献28篇。结果：HSP70不仅在细胞内发挥重要的作用,还可以通过其特有机制释放到细胞外。细胞外HSP70有重要的生物学功能．存在于细胞外的HSP70能够发挥抗肿瘤免疫作用。应用细胞外HSP70／HSP70-PCs制成特异性抗肿瘤疫苗,为肿瘤的治疗提供新的思路。结论：细胞外HSP70的肿瘤免疫作用及在肿瘤疫苗方面的应用,将有望成为肿瘤治疗的新方法。     

热休克蛋白70应用于肿瘤生物治疗的研究思路与展望

热休克蛋白70是一个强有力的免疫佐剂，它作为分子伴侣参与、促进和维持新生多肽的正确折叠，并调节细胞的生长、发育、分化、死亡。同时又作为一种内源性保护物质保护自身。可多方面活化机体特异性和非特异性免疫反应，产生抗肿瘤免疫效应，在肿瘤的生物治疗方面有着更好的研究前景。     

热休克蛋白70的结构及其生物学功能研究的新进展

热休克蛋白是一组较为保守的蛋白,是细胞抵御恶劣环境的主要蛋白之一.近来对其结构及功能的研究有了长足的进步,发现了许多新的功能如热休克蛋白在分子伴侣、肿瘤抗原的提呈及肿瘤细胞的抗凋亡等.本文就热休克蛋白70的结构及其生物学功能上的新进展作一概述,     

宫颈癌放疗前后热休克蛋白70的表达

目的:探讨热休克蛋白70在宫颈癌放疗前后的表达及意义.方法: 采用免疫组织化学法分别检测50例宫颈癌患者放疗前后热休克蛋白70的表达.结果: 放疗后热休克蛋白70的表达与放疗前相比明显降低,放疗前热休克蛋白70的表达与病理分级正相关,而放疗后其表达与病理分级负相关.结论: 热休克蛋白70的表达水平测定可以做为宫颈癌细胞的增殖、分化及放射敏感性的一个重要指标.     

热休克蛋白70在肝细胞癌中的研究进展

热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是高度保守的多肽蛋白,作为分子伴侣,在蛋白稳态、细胞凋亡、侵袭、细胞信号转导中发挥重要的作用。研究表明HSP70的表达水平与肿瘤的发生发展及转归有密切联系,其在正常情况下呈低水平表达,而在肿瘤组织中呈高表达。肝细胞癌起病隐匿,相关研究报道HSP70表达水平的高低可以作为早期肝细胞癌诊断和鉴别诊断的敏感性生物学指标,同时影响着肝细胞癌患者的治疗和预后,本文就此做一综述。     

肿瘤疫苗热休克蛋白-多肽复合物的临床应用研究进展

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)所具备的一系列免疫学功能如伴侣抗原肽、提呈和加工处理抗原肽及激活抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)等，使其在肿瘤免疫应答过程中可充当强有力的分子佐剂。大量的动物实验已经证实，分子量为70(HSP70)、90(HSP90)、96(GP96)的HSP家族与它们所携带的抗原肽在体内外组成热休克蛋白-多肽复合物(heat shock protein—peptide complexes，HSP-PCs)，在肿瘤的预防和治疗方面显示出独特的优势。     

gp96-肽复合物体外诱导脾淋巴细胞及其抗肿瘤效应

目的研究H22肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导小鼠脾淋巴细胞的特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的产生及其抗肿瘤效应。方法利用蛋白提取纯化技术、细胞培养技术、流式细胞术、CCK-8法、免疫荧光技术等。结果经鉴定获得纯化的热休克蛋白;流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8T细胞比例达到近70%,远远高于对照组的35%、26%;该活化的CTL细胞在效靶比为50∶1时的肿瘤杀伤率达72%与对照组相比具有统计学意义;激光共聚焦显微镜观察证实实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,该活化的CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫保护作用并能分泌免疫活性物质诱导H22肿瘤细胞凋亡。     

热休克蛋白70参与癌变及肿瘤耐药的分子机制

热休克蛋白70(HSP70)在许多肿瘤组织和细胞中过表达,与肿瘤的恶性程度、治疗预后密切相关.HSP70作为分子伴侣参与细胞周期调控、细胞凋亡和细胞增殖与分化,在肿瘤治疗中,抑制抗癌药物、放疗射线照射等因素介导的凋亡.HSP70不仅参与了肿瘤的发生、发展,还在肿瘤耐药中起重要作用.     

Heat shock protein 70-binding protein 1 is highly expressed in high-grade gliomas, interacts with multiple heat shock protein 70 family members, and specifically binds brain tumor cell surfaces

Chaperone proteins and heat shock proteins (HSP) are essential components of cellular protein folding systems under normal conditions; their expression and activities are upregulated during stress. Chronically stressed tumors frequently exhibit high chaperone protein levels, exploiting their anti-apoptotic mechanisms and general proteome homeostasis amidst a background of genetic instability. Co-chaperones interact with chaperones as malleable regulatory components of protein folding activity and may represent a conduit for modification of chaperone activity to the detriment of the tumor. We have initially characterized one such co-chaperone, heat shock protein 70-binding protein (HspBP) 1 from human brain tumors, their xenografts grown in immune-compromised mice, and in syngeneic murine models in immune-competent mice. Immunohistochemical analyses show HspBP1 overexpression (with unusual subcellular localizations) in patient brain tumors relative to normal brain tissue. This holds true for the xenograft and syngeneic murine tumor models. In biochemical affinity chromatography assays, HspBP1 interacts with members of the HSP70 family from brain tumor lysates and from surface-derived samples, including HSP70, glucose regulated protein (GRP)75, GRP78, and HSP110. From normal brain lysates, only heat shock cognate (HSC)70, GRP75, and HSP110 bind to HspBP1. FACS analyses indicate that HspBP1 binds to brain tumor cell surfaces, possibly via HSP70 family members, and internalizes into cells. This has implications for HspBP1 biology as well as its utility as a tumor-targeting agent. Our results suggest that HspBP1 may play a role in tumor (dys)regulation of chaperone proteins, and that HspBP1 may have extracellular roles with therapeutic implications. ( Cancer Sci  2009; 100: 1870–1879)     

Anti-Tumor Effect of Heat Shock Protein 70-Peptide Complexes on A-549 Cells

Objective: To investigate the anti-tumor immunity in vitro of heat shock protein 70-peptide complexes (HSP70-PC) from human lung cancer tissue. Methods: HSP70-PC was purified from lung tumor tissues and corresponding non-tumor lung samples with the methods of ADP-affinity chromatography, DEAE ion-exchange chromatography and Western-blot. The activation and proliferation of PBMC induced by different HSP70-PC and tumor cytotoxic reactivity to A549 cells in vitro were measured by the MTT cell proliferation assay. Results: The purified HSP70-PC had a very high purity found by SDS-PAGE and Western-blot. Human lymphocytes were sensitized efficiently by HSP70 preparation purified from lung cancer tissues and a definite cytotoxicity to A-549 cells was observed. There was significant difference with HSP70-PC purified from lung cancer, compared with the control group (P<0.001). Conclusion: High purity of HSP70-PC could be achieved from tumor tissues in this study. HSP70-PC purified from human tumor tissues can induce anti-tumor immunity in vitro mainly implemented by eliciting CTL immunity.     

放疗对宫颈癌HSP70和bcl-2蛋白表达的影响及意义

目的 :探讨宫颈癌组织中热休克蛋白 (heatshockprotein ,HSP) 70和bcl 2的表达与辐射治疗及其预后的关系。方法 :采用免疫组织化学法宫颈浸润性鳞癌47例标本检测放疗前、后 (DT812Gy ,DT2Gy/次、5次 /周 )HSP70、bcl 2的不同表达 ,并定期进行随访。结果 :HSP70在宫颈癌细胞中过表达 ,其表达与病理分级正相关 ,P <0 0 1;放疗后其表达受抑制 ,P <0 0 1,与病理分级呈负相关 ,P <0 0 1,与肿瘤消退正相关 ,P <0 0 1,与远期生存期负相关 ,P <0 0 5。bcl 2蛋白表达与病理分级负相关 ,P <0 0 5 ;放疗后其表达显著下降 ,P <0 0 1,不表达组放疗后肿瘤消退显著 ,P <0 0 1,其远期生存率显著低于阳性表达组 ,P <0 0 5。结论 :测定HSP70表达水平可以作为宫颈癌细胞的增殖、分化及放射敏感性及近、远期疗效的指标 ;bcl 2蛋白表达可作为放射敏感性及近、远期疗效判定的指标     

Both CD4+ and CD8+ T cell epitopes fused to heat shock cognate protein 70 (hsc70) can function to eradicate tumors

Vaccination with heat shock proteins (HSP) protects mice from challenge with the tumor from which the HSP were isolated. The antigenicity of HSP vaccination is thought to result from HSP-associated endogenous major histocompatibility complex class I peptides or their precursors. The vaccination effect can be achieved in an adjuvant-free manner and is mediated by CD8(+) T cells, indicating that HSP can act as a natural adjuvant and cross-prime T cells in vivo. We previously devised a recombinant vaccine composed of a CD8(+) T cell epitope fused to the carboxyl-terminus of hsc70 and demonstrated efficient generation of antigen-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) after vaccination with a few micrograms of the hsc70-CTL epitope fusion protein. The present study aimed to determine if the fusion protein vaccine could control tumor growth in vivo and whether simultaneous fusion of a CD4(+) T cell epitope to the amino terminus of the hsc70-CTL epitope would be a more potent vaccine compared to the CTL epitope alone. Ovalbumin (OVA)-derived 8 mer peptide, OVA(257-264), and 16mer peptide, OVA(265-280), were used as CD8(+) and CD4(+) T cell epitopes, respectively. Vaccination with hsc70-OVA(257-264) generated peptide specific CTL more effectively than a peptide plus incomplete Freund's adjuvant combination, and suppressed growth of OVA expressing EL4 (E.G7) and B16 melanoma tumor cells. Addition of OVA(265-280) to the amino-terminus of hsc70-OVA(257-264) (OVA(265-280)-hsc70-OVA(257-264)) enhanced the generation of the OVA(257-264)-specific CTL population, leading to better eradication of MO5 lung metastasis compared to hsc70-OVA(257-264). Our results suggest that fusion of both CD4(+) and CD8(+) T cell epitopes to hsc70 enhances tumor immunity beyond the effect of the CD8(+) T cell epitope alone.     

HSP60、HSP70、HSP90α在结直肠癌组织中的表达及其与病理组织学分级的关系

背景与目的：结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病的分子机制有待进一步阐明。目前,HSPs家族成员在某些恶性肿瘤的发生发展中的作用已有一些报道,但是这一家族成员HSP60、HSP70、HSP90α在结直肠癌组织中的表达还未见报道。本课题旨在研究结直肠癌组织中HSP60、HSP70、HSP90α的mRNA及其蛋白的表达,并分析其与病理分级的关系。方法：采用RT—PCR、免疫组化及Westernblot方法测定49例结直肠癌及其癌旁组织中HSP60、HSP70、HSP90α的表达;分析其与结直肠癌的病理组织学类型及分化程度的关系。结果：结直肠癌组织中HSP60、HSP70、HSP90αmRNA及蛋白的表达均显著高于相应的癌旁组织。癌组织较其癌旁组织HSP60、HSP70和HSP90α表达率及过表达率均有明显升高。在蛋白水平证明三种HSPs在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。但是,HSP60、HSP70及HSP90α在结直肠癌高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌的表达率和过表达率差异均无统计学意义。Western—blot表明HSP60、HSP70、HSP900t在结直肠癌组织较癌旁组织中的表达也明显增高。结论：结直肠癌组织HSP60、HSP70、HSP90α三种基因的mRNA及蛋白表达均明显高于癌旁组织．但是其与病理分级无相关关系。     

HSP70/bcl-2蛋白在宫颈癌组织中的表达及其与放疗预后的关系

目的:探讨HSP70、bcl蛳2在宫颈癌放疗中的表达及其与预后的关系。方法:采用免疫组织化学法对常规甲醛固定,石蜡包埋的宫颈浸润性鳞癌64例标本,分别检测癌组织中放疗前HSP70、bcl蛳2蛋白的表达,并对其进行定期随访。结果:HSP70在宫颈癌细胞中过表达,其表达与病理分级呈正相关(P < 0.01);与放疗后近期疗效呈正相关(P<0.01);高表达组与低表达组相比1 a、3 a无病生存期显著降低(P<0.01);bcl蛳2蛋白表达与病理分级呈负相关(P <0.05);不表达组放疗后肿瘤消退显著(P <0.01);其1 a、3 a无病生存期显著低于阳性表达组(P <0.05)。结论:HSP70表达水平可以作为宫颈癌细胞增生、分化及远期疗效判定的指标;bcl蛳2蛋白表达可作为远期疗效判定的标志。