腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人骨形成蛋白4（human bone morphogenetie protein4，hBMP-4）基因腺相关病毒载体。方法 根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入Sal Ⅰ位点，以EX-A0242M01hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒pUCl8hBMP-4。然后用EcoRⅠ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16C过夜，转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HsV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果 PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-hBMP-4重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1．5×10^12μg／ml，分泌蛋白浓度为0．124mg／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，可以满足骨组织工程的需要。     

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。     

改良法构建Ⅱ型重组腺相关病毒介导人TIMP1基因及鉴定

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）基因的Ⅱ型重组腺相关病毒（rAAV2）。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因，利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点，构建成pSNAV-TIMP1；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中，G418细胞筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK21／rAAV2-TIMP1；用具有rAAV2包装功能的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒（rHSV1-rc／△UL2）感染BHK-21／rAAV2-TIMP1，纯化后得到rAAV2-TIMP1。结果用改良法成功构建rAAV2-TIMP1，病毒滴度达到1×10^12v.g．／ml。结论成功构建rAAV2-TIMP1，为其进一步应用于基因治疗的研究提供实验基础。     

可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建

目的构建可调控人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3．1－hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE—Shuttle2的多克隆位点,将pTRE—Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno—XSystem 1 Viral DNA上,构建重组的Adeno—X－pTRE—hBMP2载体;用PacI酶将其线性化后脂质体法（Lipofectamine 2000）转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno—X Tet—Onvirus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno—X System 1 Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet—On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

融合基因骨形态发生蛋白-4/7重组腺相关病毒载体转染对骨髓基质干细胞成骨活性的作用

目的 应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy制备融合基因骨形态发生蛋白-4/7(BMP-4/7)基因的重组腺相关病毒(AAV),转染兔骨髓幕质干细胞(BMSCs),检测BMP-4/7的成骨活性.方法 采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP-4和BMP-7成熟肽cDNA,获取BMP-4/7融合基因,克隆到pGEM质粒中;从pGEM-BMP-4/7质粒中切取BMP-4/7融合基因克隆到穿梭载体,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP-4/7重组腺相关病毒载体;采用SDS-PAGE电泳榆测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达;采用ELISA法检测融合基因BMP-4/7在BMSCB中的表达.AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行碱性磷酸酶及骨钙素含量测定,观察成骨活性,以非转染组作为对照. 结果成功构建高滴度的携带BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV.BMP-4/7.AAV-BMPd/7重组质粒载体转化大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳可见29～830 KD蛋白带,大多数蛋白存在于包涵体内.ELISA检测显示经AAV转染的BMSCs中BMP-4/7蛋白有表达,随着转染MOI值的增加,BMP-4/7蛋白的表达增高(P<0.01).AAV-BMP4/7转染细胞后,碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论融合基因BMP-4/7可提高BMPs表达水平,有成骨活性,通过AAV可稳定表达.     

表达脑啡肽基因的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的构建、包装和扩增

目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒装载脑啡肽基因,并进行包装和扩增后,评价其在疼痛的转基因治疗上的作用.方法将pCMVHPPE质粒中的人前脑啡肽原基因插入单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒pHSVIRESlacZ,再用单纯疱疹病毒温敏株辅助在BHK-21细胞中包装、扩增,通过检测lacZ的表达反映扩增子病毒滴度.结果酶切鉴定证实重组子构建成功,重组扩增子质粒的包装、扩增由BHK-2l细胞的形态变化和X-gal原位检测载体lacZ的表达证实,扩增子假型病毒滴度达1×106TU/ml.结论本研究构建、包装、扩增的携带外源脑啡肽基因的假型病毒有较高感染性,这种扩增子病毒可作为疼痛基因治疗的实验研究的有力工具.     

Mummy 1911-210-1

An ancient Egyptian mummy from the collections of the National Museums of Scotland was examined using computerised tomography (CT) scanning as part of the NMS mummy project. A facial reconstruction was produced from the CT scans for comparison with a painted 'portrait' which covers the face of the wrappings. The scans indicated the mummified wrapped body of an adult male 1.65 m tall with excellent preservation of the body. An exact replica, translucent model of the skull was created from the CT scans and standard cephalometric analysis undertaken. The facial features were reconstructed onto a plaster model of the skull from known tissue depths using terracotta clay. The resultant face was compared with the portrait and an extremely close match obtained, suggesting this was an individual portrait painted around the time of death.