人67KDa层连蛋白受体前体蛋白的基因克隆、表达及其免疫原性

［摘 要］目的 克隆、表达人67KDa层连蛋白受体前体蛋白（67KDa laminin receptor precursor,LRP）并检测其免疫原性。方法 应用RT－PCR从胃癌细胞9GC7901中扩增编码LRP的cDNA,将其按照T-A克隆法重组入pUCm－T载体并进行DNA序列测定。采用DNA重组技术构建原核表达载体pQE30-LRPP;用M15/pQE系统表达6×组氨酸与 LRP的融合蛋白,并以 SDS－PAGE和Western blot鉴定所获融合蛋白。用含融合蛋白的聚丙烯酸胺凝胶颗粒免疫小鼠,以 Westem blot检测小鼠血清的抗体活性。结果 DNA测序结果证实所扩增的cDNA片段与 LRP的基因序列完全相符。SDS－PAGE检测显示,经IPTG诱导2h后,M15/pQE30－LRP总蛋白中出现一条34KDa的新生蛋白带,Western blot进一步证实该新生蛋白为融合蛋白。其免疫小鼠血清经 Western blot检测仅识别SGC7901细胞中一条大小约为42KDa的蛋白带;其血清即使被稀释2000倍,仍然显示与靶蛋白有较强的结合活性。结论 成功地克隆、表达了人LRP,并具有良好的免疫原性。     

可溶性重组蛋白EGF-Ang构建及体外细胞毒性检测

目的 构建人源化的免疫融合蛋白，以期获得具有较低免疫原性的靶向治疗药物。方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子（EGF）和人血管生成素（Ang)基因连接起来，克隆高效表达载体pET20b( )中，构建重组表达质粒pET20-EA，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白（EGF-Ang)。用MTT法检测可溶性蛋白的细胞毒辣性作用。结果 经SDS-PAGE和薄层扫描分析表明，外源蛋白表达量占菌体裂解蛋白总量的6.4%。细胞活性检测表明EGF-Ang重组蛋白在体外对过度表达EGFR的Hep2和SP2/0细胞具有明显杀伤作用。结论 人源化免疫融合蛋白EGF-Ang的构建为进一步研制具有较低免疫原性的靶向抗癌药物奠定了基础。     

GM-CSF(12-127)突变体生物学活性的研究

GM－CSF的结构与功能研究表明，N-端的1～13位氨基酸并非生物学活性所必需，且干扰与受体的结合。作者采用PCR突变的方法删除1～11位的氨基酸，保留12位的脯氨酸。突变后的基因经全序列测定证实，之后插入原核高效表达载体pBV220中表达，基因突变后的表达量及表达产物的稳定性均有所提高。大批量表达后经提取包涵体、疏水层析、离子交换层析，最终获得了纯的GM－CSF（12－127）突变体蛋白，其生物学活性比未突变蛋白有明显提高，达3×107U／mg蛋白。受体竞争结合实验显示突变体蛋白受体亲和活性增强。     

用核型多角病毒载体在昆虫细胞中表达人白细胞介素-4

将编码人白细胞介素-4（IL－4）的cDNA插入苜蓿银纹夜蛾单核多角病毒（Autogranhacalifor－nicanuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV）的多角体蛋白基因启动子下游，构建表达IL－4的重组病毒。感染该重组病毒的细胞可表达较高水平的IL－4多肽。所表达的重组IL－4具有较高的生物学活性，分子量为16KDa。     

丙型肝炎病毒核心蛋白的高效表达及纯化

用新型表达载体PGEX4T－2在大肠杆菌内高效表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。所表达的核心蛋白融合有谷优甘肽转移酶，用Sepharose4B—GSH凝胶一步亲和层析纯化即可获得高纯度的核心蛋白、该蛋白具有较好的抗原性和特异性。     

融合蛋白ABD-Fc-IL-2的真核表达及其生物学活性鉴定

目的 真核表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并检测其生物学活性。方法 通过直接PCR及重叠延伸PCR法扩增目的基因SP-ABD-Fc-IL-2,连接至载体pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2。将重组质粒转染CHO-S细胞表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并进行Protein A beads亲和层析纯化。Western blot法检测纯化融合蛋白的特异性,CTLL-2/MTT细胞增殖比色法测定其生物学活性,pull down/Western blot法检测融合蛋白中链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(albumin-binding domain,ABD)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的相互作用。结果重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。纯化融合蛋白ABD-Fc-IL-2纯度达90%,可与鼠抗IL-2单克隆抗体发生特异性结合,生物学活性为3.29×108IU/mL,融合蛋白中ABD与HSA可相互结合。结论 真核表达的融合蛋白ABD-Fc-IL-2具有较高的生物学...     

嗜人类T淋巴细胞病毒I型核心蛋白P24基因的克隆与表达

目的 从感染HTLV－1的中国患者外周血单核细胞（PBMCs)中扩增编码HTLV－1核心蛋白P24的cDNA，并在大肠杆菌中进行表达。方法 提取感染者PBMCs基因组DNA，应用巢式PCR方法扩增出HTLV－1核心蛋白P24的cDNA并测序，与GEX-20T载体构建重组质粒，在大肠杆菌BL21中表达，采用ELISA和Western blot分析重组蛋白活性。结果 HTLV－1核心蛋白P24基因序列高度保守，构建重组载体后，在大肠杆菌中表达的重组蛋白，经检测具有较强的抗原活性。结论 成功地表达了HTLV－1型病毒的核心蛋白P24基因，为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础。     

生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达

目的 构建和筛选既能稳定、高效表达SS融合蛋白，又能使这种融合蛋白保持良好的SS抗原性和高水溶性等特点的重组质粒。方法 用 BamH I/Xho I (B/X）和 BamH I/EcoR I（B/E）双酶切，将含有SS基因的片段由pThioHis A中切出，然后分别克隆到 pT7ZZa中的相应酶切位点，得到pSSB/X（短尾）和pSS-B/E(长尾)两个重组质粒，用常规表达技术在大肠杆菌中对其进行表达。结果 pSS-B/X和pSS-B/E两个重组质粒在宿主菌BL21（DE3）中均获得表达，pSS-B/X获得高效表达后融合蛋白占菌体总蛋白的30．6％。两个表达菌经超声裂解后电泳发现，SS－B/X－ZZ和SS－B/E－ZZ这两种融合蛋白基本为可溶性蛋白，沉淀中含量极低。二者均具有良好的抗原性，结论pSS-B/X重组质粒很有希望成为SS基因疫苗的候选质粒。     

外膜蛋白C作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡表面的可行性

目的 探讨外膜蛋白C(outer membrane protein C,OmpC)作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡（outer membrane vesicle,OMV）表面的可行性。方法 构建含有ompC基因片段及金黄色葡萄球菌EsxA抗原基因（esxA基因）的重组表达质粒，转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达，表达产物进行12%SDS-PAGE分析。提取重组菌OMV，经12%SDS-PAGE分析OMV总蛋白，并采用Western blot法和纳米流式仪检测融合蛋白定位至OMV表面的情况。结果 含ompC基因和esxA基因的重组表达质粒经测序证明构建正确。融合蛋白OmpC-EsxA经12%SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约57 000的目的蛋白条带，大小与预期相符。OMV总蛋白经12%SDS-PAGE分析，可见多条蛋白条带，表明成功提取重组菌OMV。重组菌OMV表面的融合蛋白OmpC-EsxA可与小鼠抗His-Tag抗体发生特异性结合，且纳米流式仪可检测到荧光抗体标记的OMV。结论 OmpC可作为蛋白呈递平台将抗原定位至OMV表面，有望应用于抗...     

表达含凝血酶识别位点的rhGM—CSF融合蛋白工程菌的选定及 …

比较４株表达含凝血酶识别位点的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白工程菌的特性,选定用于开发的工菌株,其表达产物相对分子质量为２６０００,Ｎ端１１０００为ＭＳ２,Ｃ端１５０００为ｒｈＧＭ－ＣＳＦ,较易用凝血酶消化释放出目的蛋白。用阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析,或后二者结合进行可得到适宜人体应用的纯品,活性达到１０＾７ＩＵ／ｍｇ蛋白。     

GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定。方法IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符。Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的结构和功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌RD1区重组11 kD蛋白的克隆表达及效力

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区11kD蛋白,并检测表达产物的效力。方法构建11kD蛋白编码基因原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,离子层析柱分离纯化重组蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌11kD蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白占总菌体蛋白的33%以上,纯化后纯度达95%以上,并可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,5μg/ml11kD蛋白的效力与50IU/ml TB-PPD相当。结论重组11kD蛋白已在大肠杆菌中成功表达,并有望成为结核病皮试鉴别诊断用新试剂。     

重组蛹虫草超氧化物岐化酶脱辅基蛋白的表达、纯化及其活性重建

目的表达并纯化重组蛹虫草超氧化物歧化酶脱辅基蛋白,并考查各种金属离子对其活性重建的作用。方法用不含Cu2+和Zn2+的培养基培养重组菌株,并表达重组蛋白,采用DEAE-FF和CM-52进行纯化;在脱辅基蛋白溶液中加入Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+或Ag+,测定SOD酶活力的变化。结果蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD在不含Cu2+和Zn2+的培养基中得到表达,纯化后的样品经SDS-PAGE分析,在相对分子质量17000处出现单一条带,经活性电泳分析无酶活力;脱辅基蛋白活性重建的最适宜Cu2+浓度为0.005mmol/L,但其紫外吸收图谱与天然SOD不同;0.1mmol/L的Mn2+、Mg2+、Ni2+、Ag+重建的酶活力远低于Cu2+重建的cm-SOD的酶活力。结论已成功表达并纯化了蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD,各种金属离子只能有限地重建脱辅基Cu,Zn-SOD的活性。     

重组人B7-H4IgV融合蛋白的表达、纯化及活性

目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1∶10000,可与SP2/0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化

目的　对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法　克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果　克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。结论　表达及纯化的ureI蛋白为进一步研究打下了基础     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。