两种原代培养方法对血管平滑肌细胞收缩表型的影响

目的：探究胶原酶消化法和植块法培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）对细胞收缩表型影响的特点。方法：使用II型胶原酶消化法和植块法分别离体培养原代VSMCs,并获取第1代、第2代、第4代、第8代、第12代VSMCs,Western blot检测不同代数表型标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（SMA-α）、调宁蛋白（calponin）和骨桥蛋白（OPN）表达情况;随后检测不同培养方法间表型标志蛋白表达差异,并用划痕实验和MTT实验检测迁移、增殖水平,免疫荧光检测SMA-α胞内表达。结果：消化法最初可获得明显优于植块法的VSMCs收缩表型,表现为SMA-α和calponin高表达,OPN较低表达,增殖、迁移能力相对较弱。培养至第8代后,2种方法的细胞都发生显著的表型改变,增殖、迁移能力增强且消化法细胞呈现更强的去分化表型趋势。结论：II型胶原酶消化法可快速获得良好收缩表型的VSMCs,在第4代前具有优于植块法的收缩表型。     

改良组织块贴壁法培养小鼠气道平滑肌细胞及鉴定

目的 采用改良组织块贴壁法建立小鼠气道平滑肌细胞体外培养模型。方法 用I型胶原酶消化小鼠气道平滑肌组织块后再贴壁，培养出的小鼠原代气道平滑肌细胞经过细胞免疫荧光技术鉴定。结果 相比单纯组织块贴壁法，改良组织块贴壁法获得的原代平滑肌细胞的纯度更高[（93.0%±1.8%）vs(96.1%±1.8%),P<0.01]，酶消化法获得的平滑肌细胞的纯度（90.8%±1.9%）最低，与改良组织块贴壁法相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果还显示P5代细胞与P1代细胞相比，平滑肌细胞生长形态较前改变，呈不规则形，且α-SMA阳性表达减弱，Vimentin阳性表达增强，标志着平滑肌细胞的纯度会随传代次数增加而逐渐降低。酶消化法获得的ASMCs的增殖速度较单纯组织块贴壁法和改良组织块贴壁法获得的ASMCs的增殖速度慢（P<0.01）。结论 改良组织块贴壁法经济稳定，可在短期内培养出数量多、纯度高、活性好的小鼠气道平滑肌细胞，此法成功建立了体外培养小鼠气道平滑肌细胞的模型。     

两种分离胎盘间充质干细胞方法的比较

目的：寻找从胎盘组织中分离培养间充质干细胞的最佳方法。方法：分别采用外植块贴壁法和酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞,并对其形态、免疫表型、生长动力检测和多向分化能力进行检测。结果：流式细胞术和诱导分化实验表明酶液消化法分离得到的贴壁细胞表型符合间充质多能干细胞特征,且在合适诱导条件下能向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化,而外植块贴壁法获得的贴壁细胞弱表达CD29和CD105,仅能向脂肪细胞分化。结论：酶消化法可有效的从胎盘组织中分离间充质干细胞,增殖能力强,具备多向分化能力。     

骨膜成骨细胞分离培养的方法

目的：探讨骨膜成骨细胞分离培养的最佳方法,为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子为源,方法：分别以组织块法,酶消化法和联合法分离培养兔骨成骨细胞,观察原代培养的成功率,细胞生长曲线,成骨细胞的表型特征,结果：组织块法原代培养耗时较长,成功率低,酶消化法细胞增殖快但有大量的杂细胞掺入,联合法提高了组织块成活率,并维持了较高的成骨细胞表型,结论：胶原 时预消化的联合法能够在较短时间内获得高纯度的成骨细胞,效果优于传统的组织块法和酶消化法,有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的：建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法：采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率，MTT比色法测定细胞生长曲线。结果：两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P〈0．05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P〈0．05）。结论：选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法。方法采用组织块贴壁法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90％的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的 通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础.方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片;采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用"差速贴壁法"进行纯化.通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定.结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用"差速贴壁法"可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞.     

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的 比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法 刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果 组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27％,联合培养法成功率为70％.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论 联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.     

小鼠原代血管平滑肌细胞改良分离方法的建立

目的：建立方便、快速、高效的小鼠原代血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的分离培养方法,为相关研究提供快速获取原代VSMC的方法技术。方法：分离小鼠主动脉,用I型胶原酶消化血管组织去除内皮细胞等杂细胞;将血管切成1mm。大小组织块种植于六孔细胞培养板孔底,用分离培养液诱导原代VSMC细胞的繁殖生长。光学显微镜观察细胞形态特征;免疫组化方法鉴定VSMC特异性蛋白α-SMA的表达;RT—PCR方法检测VSMC特异性蛋白α-SMA和SM22α的mRNA表达水平。结果：本方法分离原代VSMC,3d后可见长梭状VSMC从组织块边缘长出,7d后可以进行传代。光学显微镜观察显示,分离细胞具有平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）形态特征;免疫组化分析显示,分离细胞α—SMA蛋白表达阳性;RT—PCR分析显示,分离细胞中α-SMA和SM22α在mRNA水平高表达。结论：本实验成功建立了一种简便、快捷、高效从组织块分离培养VSMC的改良方法,为快速获得原代VSMC提供了一种适用的方法技术。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

离子交换与膜超滤破例提取L—赖氨酸

采用离子交换与膜超滤耦合法，研究了用中空纤维膜提取Ｌ－赖氨酸的动力学行为。该动力学符合浓差极化－凝胶层模型，吸附浓缩过程中操作压力影响大，料液流速影响小；而在脱附浓缩过程中这种影响正好相反。建议当流速在０．１４￣０．２１ｍ／ｈ时，操作压力维持在２２．５￣２５．０ｋＰａ。     

论汗法的功效

汗法可以解除表邪,因此容易使人们认为汗法即是解表法,而只能用于治疗外感六淫邪气所致的表证.论述了汗法通过开泄腠理,不仅可以达到祛邪外出的作用,还具有宣布肺气、升阳助脾、布散津液、宣通脏腑通道的功效.     

提壶揭盖法认知

“提壶揭盖法”乃朱丹溪用催吐法治疗癃闭而首创。喻肺及膀胱为“滴水之器,上窍通而下窍之水出焉。”古今医者论及者多异。笔者认为,轻宣升阳、调畅“上焦”,凡具有开启“上焦”壅塞之气机。而“下焦”自开的的方法,如开宣肺气;益气升阳;斡旋中焦,开启气机均可归属其列,在临床上用此法治疗气机不畅、上下不通的病症。举验案一例,阐释其法。     

消法探赜

[目的] 探寻消法精义,旨在正确理解消法内涵,从而提高消法临证运用效果。[方法] 结合相关古籍文献及当代文献资料,从诊断、立法、处方、用药等多方面探析消法的理论渊源,细列消法临证运用要点,归纳整理消法应用谬误,并结合现代研究进展及临证应用范围,深入理解消法的理论内涵。[结果] 消法理论基础深厚,在历代医家临证实践中不断完善深入,其变化繁多,要义颇深,较之中医八法中他法可谓尤难。须从辨证、立法、处方、用药等多方面理解消法的丰富内涵,从“当消而不消”“不当消而消”两方面总结归纳消法临证谬误,并结合诸多现代研究,为消法作用机制及药物应用提供科学证据。且由于时代背景,社会老龄化日益加重,肿瘤患者与亚健康状态人群日益增多,消法于当今临床应用越发广泛,深入探析理解消法的内涵亦变得愈发重要。[结论] 消法理论内涵丰富,要义深妙,临证应用广泛,若能系统领悟消法精义,对于提高临床疗效具有重要价值。     

比较捣法、提插法与雀啄法三种针刺手法异同

针刺手法是影响针灸疗效的重要因素。针刺手法具有较强的实践操作性,现代医家对古籍中针刺手法的记载更有着不同的理解和发挥,故产生了种类多样的针刺手法。捣法、提插法与雀啄法均是以上下进退为主要操作形式的针刺手法,三者操作形式类似,但是,由于针刺幅度和频率不同,在临床治疗中产生的效果亦各不相同。捣法以大幅度的重捣轻提为主要操作特点,体现刺激量大、针感强的特征;提插法以幅度均匀的上提下插为主要操作特点,刺激量与针感因人因病等各异;雀啄法以进针原处的小幅度高频率的提插动作为主要操作特点,侧重于下插,刺激量与针感略小。临床应用中,可以根据病情的需要,运用不同刺激方式,对穴位发挥不同作用,从而提高临床疗效。     

微胶囊化方法

总结了各种制备微胶囊的方法和原理，结合国内外最近几年对微胶囊的研究进展，介绍了一些常用的微胶囊制备方法。     

电极法与酶法CO_2测定的相关性

目的 :探讨电极法与酶法 CO2 测定的相关性。方法 :采用 CO2 电极法与酶法对一般标本和溶血、黄疸、乳糜标本进行测定及统计。结果 :批内 CV为 :电极法 1.91%～ 2 .87% ,酶法 3.2 3%～ 4 .2 8% ;批间 CV为 :电极法 2 .13%～ 3.0 2 % ,酶法 4 .0 1%～ 5 .6 3%。二种方法线性范围均最少可达 4 8.3mmol/ L。平均回收率 :电极法 10 0 .5 7% ,酶法 10 0 .78%。相关性 :r=0 .998,且两者差异无显著意义 (P>0 .0 5 )。结论 :电极法与酶法测定 CO2 结果准确 ,相关性好 ,干扰因素少     

双波长双试剂二点法测定血糖的方法研究

目的:建立一种双波长双试剂二点法测定血糖的方法。方法:应用BECKMANCOULTER LX20全自动生化分析仪,用双波长双试剂二点法测定血糖。结果:本法与LX20电极法相关系数r=0.9986,血糖浓度在22.20mmol/L内线性良好,批内CV是2.11%~3.07%,批间CV是3.57%,平均回收率为100.6%。结论:研究结果表明,该法适用于常规批量测定血糖,且该法基本解决了溶血、脂血、黄疸对结果的影响。