耐药结核杆菌原核类泛素蛋白(Pup)-蛋白酶体系统基因表达的研究

目的:检测分析经过不同浓度的抗结核药物培养后的各组耐药结核杆菌临床分离株和原始耐药状态的耐药Mtb临床分离株原核类泛素蛋白(Pup)-蛋白酶体系统基因的表达差异,探讨研究经过不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用后,各组耐药Mtb菌株中的Pup-蛋白酶体系统的基因表达是否与新疆地区广泛流行的耐药Mtb临床分离株耐药性相关。方法:将单纯耐异烟肼的Mtb临床分离株(INH-Mtb)、单纯耐利福平的Mtb临床分离株(RFP-Mtb)、单纯耐链霉素的Mtb临床分离株(SM-Mtb)、单纯耐乙胺丁醇的Mtb临床分离株(EB-Mtb)、耐多药的Mtb临床分离株(MDR),分别在原始耐药状态、低浓度含药培养基和高浓度含药培养基上培养至对数生长期,分别提取各组耐药Mtb菌株的总RNA,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法检测各组耐药Mtb菌株在不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用的Pup-蛋白酶体系统基因的表达水平。结果:与原始耐药状态下耐药Mtb菌株相比较,经低浓度抗结核药物压力作用培养后的各组Mtb菌株,Pup基因在INHMtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR组中的表达分别下调0.74、0.23、0.28、0.57倍;Dop基因表达分别上调1.33、1.63、1.14、2.88倍;Paf A基因表达分别上调1.69、1.30、1.58、1.32倍;Mpa基因表达分别上调3.05、1.79、1.31、2.27倍,差异有统计学意义(P0.05);与原始耐药状态下耐药Mtb菌株相比较,经高浓度抗结核药物压力作用培养后的各组Mtb菌株,Pup基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR组中的表达分别下调0.58、0.37、0.43、0.78倍;Dop基因表达分别上调2.62、2.49、1.69、2.95倍;Paf A基因表达分别上调2.16、1.48、2.02、2.21倍;Mpa基因表达分别上调1.63、3.22、1.13、3.94倍,差异有统计学意义;(P0.05)。结论:经过不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用后各组Mtb菌株中Pup-蛋白酶体系统的Pup基因、Dop基因、Mpa基因和Paf A基因的表达有差异,提示结核杆菌Pup-蛋白酶体系统的基因表达与新疆地区广泛流行的耐药Mtb临床分离株耐药性相关。     

结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与结核杆菌持留性的相关性研究

目的:本研究通过诱导结核杆菌在低氧环境中进入持留状态,比较分析不同时间点、不同环境下结核杆菌Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异,探讨研究Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性的调控作用。方法:本实验以结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株(以下简称为H37Rv菌株)为研究对象,在低氧、有氧环境下进行培养,分别提取不同时间点每组样本菌株的总RNA,并进行纯度鉴定。运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的方法,分别检测各组结核杆菌菌株的Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达;比较分析不同时间点、不同环境下的各结核杆菌菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异。结果:在不同时间点对低氧环境下菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa的表达水平进行检测,Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达水平:低氧环境下,与0 d比较,Pup基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.43、2.76倍,Dop基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.38、1.91、2.54、3.28倍,Paf A基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.22、1.75、2.37、2.67倍,Mpa基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.21、2.63倍(P<0.05);以有氧环境组做对照,低氧环境下,相同时间点,Pup基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.85、2.81、2.93倍,Dop基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.20、1.76、2.01、3.01倍,Paf A基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.22、1.57、2.29、2.29倍,Mpa基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.16、1.58、2.16、2.69倍(P<0.05)。结论:低氧环境下,不同时间点,Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达量存在差异;以有氧环境组作对照,相同时间点,低氧环境下与有氧环境下Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达量也存在差异。Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性具有一定的调控作用。     

利用基因芯片技术快速检测结核杆菌耐药性的初步研究

目的：探讨利用基因芯片技术检测结核杆菌的耐药性。方法：结核杆菌耐药性检测基因芯片的制备；临床分离株结核杆菌培养和药敏检测；结核杆菌基因组DNA的制备和结核杆菌耐药基因的聚和酶链反应；基因芯片的杂交、洗涤、检测与分析。结果：临床分离株结核杆菌培养和药敏检测结果：1株为药物敏感株结核杆菌(对异烟肼、利福平、链霉素、乙肤丁醇4种药物均敏感)；4株为多耐药株结核杆菌(对异烟肼、利福平、链霉素、乙肤丁醇4种药物均耐药)；药敏检测结果与5位患者临床的诊断性治疗的结果完全一致；进一步利用基因芯片技术进行检测，检测结果与上述结果相符合。结论：利用基因芯片技术检测结核杆菌的耐药性，准确、快速、高效。     

结核杆菌PhoPR双组分系统与新疆地区耐药结核杆菌耐药性的相关性研究

<正>目的:探讨结核杆菌PhoP R双组分系统与新疆耐药结核杆菌耐药性的相关性。方法:新疆耐异烟肼、耐利福平、耐链霉素、耐乙胺丁醇、耐多药结核杆菌及药物敏感菌株分别行RT-PCR,测原始状态及抗痨药物选择压力下PhoP和PhoR基因表达及差异;复制各菌株动物模型并从肺、肝、脾分离菌株,测PhoP和PhoR基因表达及差异。结果:耐药结核杆菌PhoP和PhoR     

利用基因芯片技术快速检测结核杆菌耐药性的初步研究

目的:探讨利用基因芯片技术检测结核杆菌的耐药性。方法:结核杆菌耐药性检测基因芯片的制备;临床分离株结核杆菌培养和药敏检测;结核杆菌基因组DNA的制备和结核杆菌耐药基因的聚和酶链反应;基因芯片的杂交、洗涤、检测与分析。结果:临床分离株结核杆菌培养和药敏检测结果:1株为药物敏感株结核杆菌(对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇4种药物均敏感);4株为多耐药株结核杆菌(对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇4种药物均耐药);药敏检测结果与5位患者临床的诊断性治疗的结果完全一致;进一步利用基因芯片技术进行检测, 检测结果与上述结果相符合。结论:利用基因芯片技术检测结核杆菌的耐药性, 准确、快速、高效。     

结核杆菌的耐药机制

本世纪后半叶.由于卡介苗和现代化疗方法的问世和广泛应用,结核病已在很大程度上得到了控制。但在最近十年中,由于社会结构和爱兹病(AIDS)流行病学的变化,结核病的发生率再度抬头,并重新受到重视。应该看到,结核杆菌耐药性的发生和发展是造成结核病复升的重要原因,并已成为结核病控制工作的重大障碍。我国1990年结核病流行病学调查报告指出:临床结核杆菌分离菌株的耐药率高达39.9％,其中初始耐药率为     

杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL的构建及其功能鉴定

目的：构建多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL及其功能鉴定。 方法： 制备临床分离株多耐药结核杆菌基因组DNA，PCR扩增该株结核杆菌rpsL基因，构建及鉴定该株结核杆菌rpsL基因重组穿梭质粒PMV261/rpsL，重组穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株及其鉴定。 结果： 成功地构建了重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL；重组大肠杆菌－结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株获得成功，并且重组质粒PMV261/rpsL电转化后的结核杆菌H37Rv株对链霉素耐药。 结论： 该临床分离株多耐药结核分支杆菌对链霉素耐药的机制仅仅是由于rpsL基因的93 bp、94 bp处碱基突变所致，耐药性是一个基因突变的结果，是单基因型。     

结核杆菌异烟肼耐药与katG基因突变分子的关系

近年来,全球结核病疫情回升,结核病依然是一个全球性的、严重的公共卫生问题和社会问题.异烟肼(isoniazid,INH)是治疗结核病的主要一线药物之一,2000年第4次结核病流行调查资料显示,INH的耐药率达17.6%,仍居第一位.故结核分枝杆菌对INH耐药的问题备受关注.新疆是我国耐多药结核病(MDR-TB)的高发区,研究新疆结核杆菌耐INH的机制,建立一种对临床分离株耐药的快速检测手段,是临床迫切需要解决的问题.     

结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的序列分析

目的探讨结核分枝杆菌耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系。方法采集81例临床标本,分离结核分枝杆菌菌株,PCR扩增rpoB基因及测序,并与利福平药物敏感试验结果比较。结果27例耐利福平菌株中,20株发生rpoB基因突变(74.1%),突变位点包括531和526在内的7个位点10种突变类型,并发现新的突变位点和突变形式;54株敏感株中,1株发生突变(1.9%)。结论利福平耐药rpoB基因突变有一定区域性,为发展快速的基因诊断技术检测耐多药结核病奠定了基础。     

分析5种结核杆菌耐药基因突变与耐药水平的关系

目的：分析5种结核杆菌（M.tb)耐药基因突变的情况，了解基因突变和耐药水平的关系。方法：134例临床分离株均做传统梯度药敏试验和聚合酶链反应－单链构象多态性I（PCR－SSCP）试验。结果：耐PZA(pncA),SM(rpsL),REP(rpoB),INH(katG),EMB(embB)基因突变率分别为42．7％、72％、78％、69％和43．9％，其中，上述高耐株基因突变率分别为70％、87．2％、93．4％、80％、43．9％。低耐株分别为12．5％、28．5％、45．4％、18．7％，EMB在低耐区无基因突变，结论：M.tb耐药基因变与耐药水平联系密切，多数M.tb耐药基因突变易发生在高耐药区，也有少数菌基因突变易发生在低耐药区。     

ICU中MRSA耐药基因检测及其PFGE分型

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株进行分子分型,探讨ICU中MRSA医院感染的特点和流行规律。方法采用表型筛选和PCR扩增mecA基因方法鉴定MRSA菌株。脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）进行分子分型。结果12株金黄色葡萄球菌表型筛选为MRSA,MRSA产生A型、B型、C型和D型4种耐药表型,优势耐药模式是A型（75．0％）,MRSA对苯唑西林、阿莫西林／克拉维酸和氨苄西林／舒巴坦等10种抗生素产生100％耐药性,11株MRSA携带mecA基因,携带率为91．7％,PFGE指纹图谱分两型,分别为R1型和R2型,11株MRSA为R1型（91．7％）,R1型各株间相似度为100％。结论ICU可存在MRSA爆发流行,MRSA产生多重耐药性（MDR）,MRSA携带mecA基因可表现为MDR,PFGE分型是理想的分子流行病学溯源手段。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型及药敏分析

目的 研究临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SCCmec基因型及亚型并对其耐药性进行分析,为临床治疗和流行病学研究提供依据.方法 应用PCR法检测50株MRSAmeeA基因和SCCmec的基因型及亚型.用纸片扩散法进行药敏试验.结果 50株MESA mecA基因均为阳性.45株为SCCmecⅡ型,3株为SCCmecⅢA型,2株为SCCmec Ⅱ型.未见SCCmee Ⅰ和SCCmecⅣ型.携带SCCmecⅡ、SCCmecⅢ或SCCmecⅢA的菌株均为多重耐药株.结论 50株MESA为多重耐药菌株,以SCCmecⅢ型为主.     

临床常见革兰阴性菌对碳青霉烯类药物耐药性检测

目的完善我国西南地区临床常见革兰阴性细菌对碳青霉烯类药物耐药的分子流行病学资料。方法对2007年5月至2008年5月间从四川省4家医院采集的381株耐碳青霉烯类药物的临床菌株,进行4大类15种抗菌药物耐药性检测和产金属-β-内酰胺酶（MBLs）菌株筛选,并采用PCR对产MBLs菌株进行常见耐药基因的扩增。结果381株耐碳青霉烯类药物菌株中筛选到122株MBLs表型阳性的菌株,分别有45株产blaIMP（31株产blaIMP-9、8株产blaIMP-1、6株产blaIMP-4）、52株产blaVIM（48株产blaVIM-2,4株产blaVIM-1）、7株产blaNDM-1和16株菌株产blaSIM-1。此外,还有2株MBLs表型试验阳性菌株未鉴定出任何已知MBLs基因。结论381株受试菌株以多重耐药或全耐药菌株为主,我国西南地区耐碳青霉烯类药物临床菌株主要流行IMP型和VIM型MBLs,其中以产blaIMP-9和产blaVIM-2最为常见。     

VVC患者临床分离白念珠菌Cap1、Mrr1和MDR1在唑类药物交叉耐药中的作用

目的探讨白念珠菌锌簇转录因子Cap1、Mrr1基因突变／高表达及外排泵基因MDR1的mRNA表达水平在唑类抗真菌药物氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）、伏立康唑（VRC）交叉耐药中的作用。方法收集山西医科大学第二医院皮肤性病科门诊疑似外阴阴道念珠菌病（VVC）患者阴道分泌物标本,进行真菌直接镜检、培养、分离鉴定和体外药物敏感性试验,获得试验用白念珠菌耐药和敏感菌株共68株。采用PCR方法扩增68株白念珠菌临床分离菌株Cap1、Mrr1基因,并进行双向测序,应用Blast软件,将测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,分析基因突变情况,实时荧光定量PCR检测锌簇转录因子Cap1、Mrr1和外排泵基因MDR1的mRNA表达水平。结果Cap1测序中1株ITR、VRC交叉耐药菌株出现P311S错义突变。Mrr1测序中1株FCA、ITR、VRC交叉耐药菌株出现5个错义突变（T917M,I＇923I,E1020Q,F1032L,S1037L）;FCA、ITR、VRC交叉耐药菌株组中Cap1／Mrr1／MDR1的mRNA表达量分别高于敏感菌株组;CA、ITR、VRC交叉耐药菌株组Cap1和MDR1（r=0．173,P=0．571）,Mrr1和MDR1（r=-0．091,P=0．766）,Cap1和Mrr1基因（r=0．025,P=0．936）的mRNA表达量不相关（均P〉0．05）。结论Cap1和Mrr1的突变可能和唑类药物交叉耐药有关。     

结核杆菌对常见抗结核药物的体外敏感性测定

目的了解江汉油田矿区结核杆菌对抗结核药物的敏感性。方法对本区220株结核杆菌采用改良罗氏培养基绝对浓度法试验。结果我区初始耐药率为42.7%;其中耐2药及2药者分别占38.3%和14.9%;耐药种类最多达7种。结论应加强抗结核药物的耐药性监测,根据药敏试验选择科学有效的化疗方案。     

兽用抗菌药物耐药性研究

本报道了对兽用抗菌药耐药性的研究情况，主要研究内容包括：①对广东地区动物源大肠杆菌耐药性的调查，从鸡、猪、牛、环境和饲养员等分离大肠杆菌1524株，测定了这些菌株对环丙沙星等21种抗菌药物的敏感性。结果表明，动物源分离的大肠杆菌普遍存在耐药性，其中耐药率最高的为青霉素类、四环素类和磺胺药，这与动物用药的强度、频率呈正相关。②对大肠杆菌耐药I型整合子／基因盒的分子流行病学调查，经PCR扩增等方法测定了192株耐药大肠杆菌的T型整合子／基因盒，发现有105株携带I型整合子，检出率为54.7％，这些整合子多数位于质粒上。③对耐氰喹诺酮类的大肠杆菌、鸡毒支原体、沙门氏菌的gyrA基因突变进行了研究，发现这些耐药菌株的gyrA基因可发生1个位点以上的突变，高水平耐药菌株常发生2个位点突变，个别菌株还可以发生3个位点突变。本还对耐药性的监控措施进行了讨论。     

汕头地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药分析

目的：了解汕头地区对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌（PA）的耐药情况及耐药机制。方法：收集临床分离耐亚胺培南的PA共141株，双纸片协同实验检测金属酶表型，PCR法检测外膜孔蛋白OprD2和金属β内酰胺酶（IMP、VIM、SPM）基因。结果：耐亚胺培南的铜绿假单胞菌均为多重耐药茵，对头孢哌酮／舒巴坦的耐药率较低，未发现产金属酶菌株，仅22株菌株扩增出OprD2基因。结论：头孢哌酮／舒巴坦可作为本地区临床治疗耐亚胺培南铜绿假单胞茵所致感染的首选经验用药，OprDa表达减少或不表达可能是临床分离铜绿假单胞茵对亚胺培南耐药的主要机制。     

老年人亚胺培南耐药铜绿假单胞菌耐药性研究

目的 明确我院老年病人临床分离铜绿假单胞菌的耐药性、同源性及耐碳青霉烯菌株的基因型。方法 收集我院2006年5月-2009年5月自临床老年病人分离的262株铜绿假单胞菌,纸片扩散法测定其对16种抗菌药物的耐药性;琼脂稀释法和E test法测定耐碳青霉烯菌株对14种抗菌药物的MIC值,PCR扩增及克隆测序分析金属酶基因型。脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析携带金属酶基因型菌株的同源性。结果 262株铜绿假单胞菌中筛选到104株耐碳青霉烯。104株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌对氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦两个含舒巴坦制剂药物耐药率分别为78.9％和35.9％,对多黏菌素E耐药率最低为6.0％,对米诺环素耐药率58.3％,其余抗菌药物耐药率均大于70.0％;104株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中12株携带金属酶基因,10株检测到有携带VIM-2基因的1类整合子。PFGE分型中12株菌株属于5个克隆株。结论 在我院流行的亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中,金属酶基因不是最主要的基因型,金属β-内酰胺酶均为VIM-2型金属酶,耐药基因盒分布于不同的1类整合子中,整合子播散是最主要的流行方式。     

耐甲氧西林葡萄球菌的耐药状况分析

目的 分析耐甲氧西林葡萄球菌的耐药状况,了解葡萄球菌耐药的流行病学特征.方法 对251株临床分离的葡萄球菌进行耐药性检测,分析其药敏试验结果.结果 251株葡萄球菌中,金黄色葡萄球菌162株,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA) 62株,阳性率为38.3%;凝固酶阴性葡萄球菌89株,其中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase negative Staphylococcus,MRCNS) 63株,阳性率为70.8%;所有菌株对万古霉素均敏感.结论 耐甲氧西林葡萄球菌对抗生素的耐药状况较为严重;未分离出万古霉素耐药株.     

靶向沉默Mcl-1基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响

 目的: 通过RNA干扰技术特异性沉默 Mcl-1 基因,探讨下调 Mcl-1 基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响。方法: 分别用制备好的新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株(简称强毒株)、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(简称H37Rv)、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra(简称H37Ra)和卡介苗(BCG)菌悬液感染BALB/c小鼠,再以筛选并构建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型,同时设立相应对照组,于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬细胞,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测各组巨噬细胞的凋亡水平。结果: 小鼠被不同毒力的结核杆菌感染后其腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平均有不同程度的升高,其中以感染了强毒株和H37Rv的腹腔巨噬细胞升高最为明显(P<0.05);应用RNA干扰技术沉默 Mcl-1 基因后,Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05);流式细胞术分析显示,下调 Mcl-1 基因的表达可诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。结论: 应用Mcl-1-shRNA可有效沉默 Mcl-1 在感染了不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞中的表达,并能上调巨噬细胞的凋亡水平。