脂多糖诱导血脑屏障破坏中JNK信号通路与基质金属蛋白酶-9作用机制的研究

目的探讨在脂多糖(LPS)诱导血脑屏障(BBB)破坏中紧密连接Occludin、ZO-1表达的变化以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用机制。方法利用MTT法检测不同浓度LPS以及SP600125(JNK信号通路抑制剂)对人脑微血管内皮细胞(h CMEC/D3)活力的影响。Western blot法检测不同浓度LPS对Occludin、ZO-1蛋白表达的影响。用SP600125阻断JNK信号通路,Western blot法检测LPS诱导的JNK磷酸化水平、Occludin和ZO-1蛋白表达的变化,qRT-PCR法检测Occludin、ZO-1及MMP-9 mRNA表达的变化。用SB-3CT特异性抑制MMP-9活性,Western blot法检测LPS诱导的Occludin蛋白表达的变化。结果 LPS、SP600125浓度分别在10μg/ml(0.19±0.02)和0.22μg/ml(0.18±0.01)以下时对h CMEC/D3细胞活力无明显影响(P>0.05)。不同浓度LPS(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)处理h CMEC/D3后Occludin和ZO-1蛋白的表达量均下降。LPS处理h CMEC/D3后JNK磷酸化水平增高,而抑制JNK磷酸化可以明显上调LPS诱导的Occludin蛋白(0.87±0.03、P<0.001)及其mRNA(1.00±0.09、P<0.05)的表达,但对ZO-1蛋白(1.14±0.06、P>0.05)及其mRNA(0.81±0.03、P>0.05)的表达无明显影响。另外,抑制MMP-9的活性可以明显上调Occludin蛋白的表达(0.53±0.06、P<0.01),阻断JNK信号通路可显著降低LPS诱导的MMP-9的高表达(0.77±0.08、P<0.001)。结论 LPS可下调紧密连接Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA的表达导致血脑屏障破坏;LPS可通过激活JNK信号通路,调节Occludin蛋白及其mRNA的表达,而对ZO-1蛋白及其mRNA表达的影响可能通过其他信号通路实现;LPS诱导Occludin蛋白的下调可能与MMP-9的高表达有关,JNK信号通路可能参与了此过程的调控。     

糖尿病大鼠脑组织紧密连接蛋白Occludin 表达的变化

目的:研究糖尿病大鼠脑组织紧密连接蛋白Occludin表达的变化.方法:30只雄性SD大鼠随机分为糖尿病1个月组、糖尿病3个月组及正常对照组.腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型,采用逆转录PCR和Western blot法检测大鼠脑组织Occludin mRNA和蛋白的水平.结果:糖尿病1个月组和3个月组大鼠脑组织Occludin mRNA水平[(0.20±0.21),(0.06±0.02)]均较正常对照组(1.00±0.00)显著降低(均P<0.05),且糖尿病3个月组Occludin mRNA水平明显低于糖尿病1个月组(P<0.05).糖尿病1个月组和3个月组大鼠脑组织Occludin蛋白水平[(0.58±0.01),(0.29±0.01)]比正常对照组(1.02±0.06)显著降低(P<0.05-0.01),且糖尿病3个月组Occludin蛋白水平明显低于糖尿病1个月组(P<0.05).结论:糖尿病大鼠脑组织Occludin表达明显降低,并随着病程延长其降低更明显;提示糖尿病使血-脑屏障受到损害.     

急性脑出血血肿周围组织水通道蛋白-4表达与血脑屏障损伤的关系

目的研究急性脑出血血肿周围组织水通道蛋白-4表达与血脑屏障损伤之间的关系。方法采用立体定向注射无肝素自体动脉血制作大鼠脑出血模型,对脑含水量、血脑屏障损害进行观察,RT-PCR和免疫印迹检测水通道蛋白-4 mRNA和蛋白表达,同时观察参与紧密连接的咬合蛋白(occ lud in)和带状闭合蛋白-1(zona occ ludens-1,ZO-1)表达和水通道蛋白-4表达的相关关系。电镜下观察不同时间点血脑屏障和神经星形胶质细胞终足改变。结果电镜提示出血后6 h血脑屏障紧密连接未破坏,但神经胶质细胞终足已经肿胀。与假手术组相比,此时的脑出血血肿周围组织大鼠水通道蛋白-4表达增高(P<0.05):脑出血3 h水通道蛋白-4 mRNA开始增强(吸光度比值1.05±0.13),水通道蛋白-4蛋白6 h开始增强(0.62±0.05),第3天达峰值(1.46±0.02)。电镜和伊文蓝显示血脑屏障从12 h才开始明显损害[12 h脑组织伊文蓝含量为(12.91±0.64)μg/g],同时ZO-1和occ lud in蛋白表达减弱,分别为0.71±0.05和0.72±0.04。与水通道蛋白-4蛋白表达呈负相关。结论脑出血后水通道蛋白-4增高和血脑屏障损伤之间存在相关关系;水通道蛋白-4增高和星形胶质细胞肿胀可能是血脑屏障损伤的因素之一。     

慢性低氧对小鼠脑微血管内皮细胞RAGE和LRP-1表达的影响

目的研究慢性低氧状态下血脑屏障上β淀粉样蛋白（amyloidD，Aβ）转运体——晚期糖基化终产物受体（RAGE）及低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP-1）表达的变化。方法将鼠脑微血管内皮细胞（BMVECs）分别进行正常气体培养（正常对照组）以及24h、36h及48h的低氧培养，用RT—PCR法和WesternBlot法分别检测细胞RAGE和LRP-1mRNA和蛋白的表达。结果低氧24h组RAGEmRNA和蛋白表达低于正常对照组（P〈0．05），低氧48h组RAGEmRNA和蛋白表达高于正常对照组（P〈O．05），低氧24h、36h及48h组RAGEmRNA和蛋白表达呈时间依赖性增高（P〈0．05）；低氧各组LRP-1mRNA和蛋白表达较正常对照组降低，呈时间依赖性（P〈0．05）；RAGE／LRP，1mRNA和蛋白表达呈时间依赖性增高（P〈0．05）。结论在慢性低氧状态下，血脑屏障BMVECs表达RAGE上调，LRP-1下调，RAGE／LRP-1比值增高，推测可能由此增加了Ap的净入脑量。     

替米沙坦对小鼠抗衰老klotho蛋白表达的影响及机制

目的观测替米沙坦对小鼠脑脉络丛klotho蛋白表达的影响及机制。方法 32只昆明小鼠,随机分为四组,即正常对照组、一氧化氮合酶(NOS)抑制组(L-NAME组),替米沙坦组和L-NAME+替米沙坦组,连续处理4周。免疫组织化学方法观察klotho蛋白表达;Western blot检测klotho蛋白表达水平的变化;RT-PCR检测RhoA和ROCK mRNA表达水平。结果与对照组比较,L-NAME组RhoA和ROCK mRNA表达升高(P<0.01);klotho蛋白表达明显降低(P<0.01)。给予替米沙坦后,RhoA和ROCK mRNA表达降低(P<0.01);klotho蛋白表达明显增高(P<0.01)。结论替米沙坦可干预L-NAME所致的klotho蛋白表达下调,其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路活性有关。     

低频率电刺激通过调控Rho/ROCK/NF-κB途径对癫痫大鼠作用的研究

目的探究低频率电刺激(LFS)对癫痫的作用及其可能的作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为对照组、癫痫模型组、假刺激组和LFS治疗组,每组15只。记录大鼠Racine评分和脑电图,Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力;HE染色和尼氏染色检测大鼠海马CA1区病理学变化;TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡;ELISA检测大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平;Western blotting检测大鼠海马RhoA、ROCK1、ROCK2、p65、p-p65和凋亡相关基因蛋白表达;RT-PCR检测大鼠海马RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA表达。结果癫痫模型组大鼠出现了连续性棘波。癫痫模型组大鼠的Racine评分;神经元细胞凋亡率;Bax、c-caspase3和p-p65/p65蛋白表达;RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白表达;血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平较对照组升高,差异有统计学意义(P0.05)。癫痫模型组大鼠的空间学习记忆能力、神经元数量、尼氏体数量、Bcl-2蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义(P0.05)。LFS治疗组大鼠波峰下降。LFS治疗组大鼠的Racine评分;神经元细胞凋亡率;Bax、c-caspase3和p-p65/p65蛋白表达;RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白表达;血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平较假刺激组降低,差异有统计学意义(P0.05)。LFS治疗组大鼠的空间学习记忆能力、神经元数量、尼氏体数量和Bcl-2蛋白表达较假刺激组升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 LFS可能通过抑制Rho/ROCK/NF-κB途径来抑制炎症产生,从而发挥抗癫痫作用。     

miR-451/MIF信号通路在脑出血后血脑屏障破坏中的作用

目的 观察脑出血后微小RNA-451(MicroRNA,miR-451)/巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migrationinhibitory factor,MIF)信号通路的变化及其对血脑屏障紧密连接的影响。方法 体外培养人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,hBMECs),随机分为对照组和血红素组; 对照组细胞给予常规培养基,血红素组细胞的培养基中加入60 μM血红素分别培养12、24和48 h,实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测各组各时间点miR-451转录水平; 体外培养hBMECs细胞,随机分为空白组、血红素组、阴性模拟物组和miR-451模拟物组,培养24 h; 酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELASA)检测各组培养基上清中MIF分泌水平,实时荧光定量PCR检测各组MIF mRNA的转录水平及紧密连接相关蛋白[咬合蛋白Occludin、闭合蛋白Claudin和闭合小环蛋白1(Zonula occluden-1,ZO-1)]mRNA的转录水平。结果 hBMECs细胞培养基中加入60 μM血红素分别作用12、24和48 h后各时间点的miR-451转录水平均低于同时间点的对照组(P均<0.05),且24 h时miR-451转录水平最低。各组hBMECs细胞培养24 h后血红素组培养基上清中的MIF蛋白的水平和细胞内MIF mRNA的转录水平均高于空白组(P均<0.05); miR-451模拟物组上清中的MIF蛋白水平和细胞内MIF mRNA的转录水平均低于阴性模拟物组(P均<0.05)。各组hBMECs细胞培养24 h后血红素组的细胞内Occludin mRNA,Claudin-5 mRNA和Zo-1 mRNA的转录水平低于空白组(P<0.05),miR-451模拟物组细胞内Occludin mRNA,Claudin-5 mRNA和Zo-1 mRNA的转录水平均高于阴性模拟物组(P<0.05)。结论 miR-451/MIF信号通路可能参与了脑出血后血脑屏障紧密连接的破坏,给予外源性补充miR-451模拟物可能有助于维持血脑屏障的完整性。     

细胞外信号调节激酶1/2与Rho激酶作用对脑梗死后神经血管单元的影响

目的研究脑梗死后细胞外信号调节激酶1/2(ERK_(1/2))和Rho激酶(ROCK)两条信号通路通过相互作用激活下游效应分子多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)来调控脑梗死后神经血管单元。方法该实验分为两个部分:35只SD大鼠随机分为假手术组(s)和脑梗死组(M),脑梗死组根据脑梗死后时间不同又分为1h、3h、12h、24h、3d和7d六个亚组,分别采用westem blot检测假手术组及脑梗死组各亚组ERK_(1/2)、ROCK蛋白表达水平。35只SD大鼠随机分为对照组、模型组、U0126组、Fasudil组和U0126+Fasudil组,分别检测神经功能、脑梗死面积以及ROCK、ERK_(1/2)及PARP-1的蛋白表达水平。结果假手术组各个时间点总ERK_(1/2)/2和p-ERK_(1/2)表达相同。脑梗死组总ERK_(1/2)表达不变,p-ERK_(1/2)表达先降低后升高,24h时达最高峰。脑梗死组ROCK的表达随时问的延长逐渐升高,12h表达达高峰,随后表达下降。模型组与对照组相比,p-ERK_(1/2)、ROCK及PARP-1的表达显著提高(P0.05);与模型组相比,Fasudil组p-ERK_(1/2)的表达下降(P0.05),而U0126组ROCK表达无变化(p0.05),Fasudil组、U0126组及Fasudil组+U0126组PARFP-1的表达显著下降(P0.05),其中以U0126+Fasudil组下降最为显著。结论 ERK_(1/2)和ROCK都参与了脑梗死后脑组织的损伤,ERK_(1/2)可能作为ROCK的下游效应分子,与ROCK共同调节PARP-1的表达进而调控脑梗死后神经血管单元的存亡。