重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白，获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10，插入到同样双酶切的表达载体pET32a，构建重组载体IL-10／pET32a，测序正确后转化E.coli BL21（DE3），不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白，SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达，ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确，诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx，同时也存在包含体融合蛋白，经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10，MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx，有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

hBAFF-R-Fc融合分子的构建、表达与鉴定

目的 构建人hBAFF-R-Fc基因的真核表达质粒,并表达有生物学活性的人hBAFF-R-Fc融合蛋白.方法 化学合成法合成人hBAFF-R膜外区cDNA编码基因,酶切测序证实后,与hIgG4.Fc/Leu235Glu突变体一起导入线性化pSec/WG真核表达载体,阳性重组体酶切测序证实后,采用脂质体法稳定转染CHO细胞,用夹心ELISA检测其表达;收集的蛋白经蛋白A亲和纯化,以SDS-PAGE与Western blot进行鉴定并检测hBAFF-R-Fc的活性.结果 测序证实构建的hBAFF-R膜外区与hBAFF-R-Fc cDNA阅读框完整,EIJSA证实转染hBAFF-R-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hBAFF-R-Fc蛋白,SDS-PAGE与 Westernblot鉴定证实其为hBAFF-R-Fc蛋白.hBAFF-R-Fc蛋白对活化后的B细胞有抑制增殖的作用.结论 成功构建了人hBAFF-R-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的hBAFF-R-Fc蛋白在CHO细胞上获得了稳定表达.为进一步研究该蛋白在狼疮性肾炎等自身免疫性疾病治疗中的作用奠定了基础.     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.     

人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析

TIL具有抗肿瘤的活性 ,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用。本实验拟扩增GrB全序列 ,构建GrB的原核表达载体 ,从而建立其原核表达体系 ,获得高效表达的重组GrB ,纯化蛋白。用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞 ,并抽提RNA ,RT PCR方法获得GrB的全长 ,并重组到pGEX 4T 1中 ,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定 ,IPTG诱导pGEX GrB转化的BL2 1菌 ,大量纯化表达产物 ,并通过SDS PAGE、Westernblot分析表达产物 ,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用。结果 :限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段 ,GrB准确克隆入pGEX 4T 1 ,成功的构建pGEX GrB ,经诱导表达出与GST融合的蛋白 ,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带 ,并能与GrB特异性抗体结合。体外实验表明 ,GrB能抑制Hep2细胞的增殖。成功构建了pGEX GrB ,并成功表达、大量纯化GrB蛋白 ,其能够抑制Hep2细胞的增殖。     

SD大鼠βB2-晶体蛋白的克隆、表达与纯化

目的得到大量纯的βB2-晶体蛋白,为研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.方法从SD大鼠晶状体中抽提总RNA,用RT-PCR法克隆βB2-晶体蛋白的cDNA,装入原核表达载体pGEX-4T-1后用萘啶酮酸(IPTG)诱导表达;用GST纯化系统纯化并用蛋白水解酶对融合蛋白进行酶切.结果βB2-pGEX重组质粒经测序及限制性内切酶分析等鉴定,与预期结果一致;IPTG诱导后,蛋白质在大肠杆菌BL21中得到高效表达.纯化酶切后,经Westen blot 方法验证,得到了高纯度的βB2-晶体蛋白.结论成功构建了βB2-pGEX原核表达载体,高效表达了βB2-GST融合蛋白,经纯化和酶切得到了高纯度的βB2-晶体蛋白,为进一步研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.     

SD大鼠βB2-晶体蛋白的克隆、表达与纯化

目的得到大量纯的βB2-晶体蛋白,为研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.方法从SD大鼠晶状体中抽提总RNA,用RT-PCR法克隆βB2-晶体蛋白的cDNA,装入原核表达载体pGEX-4T-1后用萘啶酮酸(IPTG)诱导表达;用GST纯化系统纯化并用蛋白水解酶对融合蛋白进行酶切.结果βB2-pGEX重组质粒经测序及限制性内切酶分析等鉴定,与预期结果一致;IPTG诱导后,蛋白质在大肠杆菌BL21中得到高效表达.纯化酶切后,经Westen blot 方法验证,得到了高纯度的βB2-晶体蛋白.结论成功构建了βB2-pGEX原核表达载体,高效表达了βB2-GST融合蛋白,经纯化和酶切得到了高纯度的βB2-晶体蛋白,为进一步研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.     

人IFN-ε的表达、纯化及生物学特性研究

目的 表达并纯化人IFN-ε,并对其理化特性和生物学特性进行初步研究. 方法 利用PCR技术以人基因组DNA为模板,获得目的片段的全基因序列后,克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组表达载体pET-32a(+)/IFN-ε,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达进行了优化.产物的表达形式为包涵体,经过纯化复性后,获得高纯度的活性蛋白IFN-ε.对IFN-ε的理化性质和抗病毒活性、抑制肿瘤细胞增长活性、刺激细胞产生抗病毒蛋白的活性进行了鉴定. 结果 IFN-ε以包涵体形式表达,纯化后纯度大于95%,抗病毒活性为1.2×105 IU/mg,能够抑制肿瘤细胞的生长,并能诱导细胞产生抗病毒蛋白MxA. 结论 成功表达了人IFN-ε蛋白,并证明此蛋白质具有抗病毒和抗细胞增殖的活性.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ldh-1基因的序列分析及原核表达

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株携带的ldh-1基因进行克隆、表达,为L．乳酸脱氢酶（L．LDH）功能研究奠定基础。方法根据金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因序列,设计一对特异性引物,以MRSA临床分离株（菌株号：1758）DNA为模板PCR扩增ldh-1,纯化DNA进行BamHI、Xhol I双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET一28a（＋）连接,转化大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用1PTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。诱导表达后的重组菌经超声破碎离心后,使用Ni2＋_NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果成功构建重组表达质粒pET．28a—ldhl,基因测序结果显示,扩增的ldhl基因全长956bp,与金黄色葡萄球菌Mu50株ldhl基因的序列同源性为100％。IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳在39-103Mr处见目的条带,Westernblot验证了重组蛋白L．LDH的表达。该蛋白呈可溶性表达,纯化后获得0．5g／L的重组蛋白。结论在MRSA（菌株号：1758）1~床分离株中成功克隆及表达了ldh．1基因,获得了纯化的重组蛋白．为进一步进行L．LDH的功能研究奠定了基础。     

重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定

目的：纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白。方法：重组菌经IPTG诱导后，表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶（GST）标签的融合蛋白，并以包涵体形式存在。将包涵体变性、复性后，采用Glutathione Sepharose 4B亲和色谱对核蛋白进行纯化，并用夹心ELISA和Western blot检测纯化蛋白。结果：表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白，获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白，再经凝血酶酶切，第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白，洗脱峰为GST。纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS－PAGE单点纯，并具有良好的抗原活性。结论：Glutathione Sepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法。     

重组人胰岛素类似物DesB30的结构及生物效价分析

目的确认重组人胰岛素类似物DesB30的结构,分析其生物效价。方法在毕赤酵母中构建表达含有短C肽AAK并去掉B链第30位氨基酸（T）的人胰岛素原类似物HMPIDesB如,经胰蛋白酶酶切纯化获得DesB如。利用N末端氨基酸序列测定,质量肽谱分析,圆二色谱等方法进行结构确认及质量分析。利用RP—HPLC法,小鼠血糖法,脂肪细胞法分析其生物效价。结果DesB30的N端氨基酸序列、二硫键配对、圆二色谱值与理论值一致,其生物效价与人胰岛素基本一致。结论毕赤酵母分泌表达的胰岛素类似物DesB30结构正确,胰岛素去掉B链第30位的苏氨酸,不影响其生物活性。     

Sox2-R9-EGFP融合蛋白的表达及穿膜能力鉴定

构建、表达、纯化、鉴定Sox2-R9-EGFP融合蛋白,验证其在体外培养的成纤维细胞中的转导活性。以胎猪原始生殖嵴为材料提取总RNA,反转录成cDNA第一链,设计带9聚精氨酸（R9）的特定引物,从cDNA中扩增出猪Sox2基因,克隆到pET-28a-EGFP载体中,经酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,Ni2＋柱亲和层析纯化和SDS-PAGE检测表达产物后,将Sox2-R9-EGFP蛋白作用于体外培养的猪胎儿成纤维细胞中以观察其转导活性。成功构建Sox2-R9-EGFP融合蛋白原核表达载体,纯化后蛋白经SDS-PAGE检测证实融合蛋白片段大小正确,加到培养的猪胎儿成纤维细胞中可观察到Sox2-R9-EGFP融合蛋白能进入细胞,且部分可定位于细胞核。获得了Sox2-R9-EGFP原核蛋白表达载体,R9能介导Sox2蛋白进入细胞,为进一步利用重组蛋白建立诱导性多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS细胞）的研究奠定了基础。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

恶性疟原虫信号肽肽酶原核表达载体的构建及融合表达蛋白的鉴定

目的构建恶性疟原虫PfSPP基因pMAL-p2x的原核表达载体,并鉴定表达,为其功能研究奠定基础。方法体外培养恶性疟原虫（3D7株和FCR3株）,提取虫体总RNA,进行反转录后,采用RT-PCR扩增PfSPP的全编码区基因,将其克隆入原核表达载体pMAL-p2x,PCR、双酶切鉴定重组质粒,并进行序列测定,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌进行表达获得MBP-PfSPP融合蛋白,采用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pMAL-PfSPP,转化菌经诱导表达出分子量约为77 000Mr的MBP-PfSPP融合蛋白,抗MBP多克隆抗体可特异性地识别表达的融合蛋白。结论成功表达具有多个跨膜结构的膜蛋白PfSPP,从而为深入研究PfSPP的酶活性及生物学功能奠定基础。     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

两种具长效性重组人血清白蛋白／干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

目的对两种长效干扰素α融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白（rHSA／IFNα2a）或重组人血清白蛋白,干扰素α2b融合蛋白（rHSA／IFNα2b）的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化,随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的融合蛋白纯度在98％以上;N端前15个氨基酸序列与理论序列相同;质谱分子量分别为85640．8D和85781．5D;圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变;等电点DI约在5．1左右;为非糖基化蛋白;紫外光谱呈典型蛋白质光谱;自由巯基含量测定值为1．4;肽图批次问一致;肽质量指纹图谱可匹配分别达83％和82％;对制备的2个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求;融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞生物比活性约为2．5×10^5IU／mg,并且2个融合蛋白生物比活性测定值无不同,由此,获得了符合临床用药标准的原料药。结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2b融合蛋白》2个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的诱导人腺苷激酶重组蛋白在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a（＋）连接构建的重组蛋白表达载体pET30a（＋）／ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞。1mmol／L的1PTG诱导重组蛋白表达。离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体。用含2mol／L和4mol／L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白。随后用含8mol／L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀。用Ni—NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8mol／L尿素的洗脱缓冲液洗脱。收集样品透析复性。结果成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85％以上的重组蛋白。结论人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化,为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础。     

人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达

目的构建人谷草转氨酶（AST）高效重组表达体系。方法优化编码人 AST的核苷酸密码子,合成人 AST新的基因,并将其克隆至 pRSF-Duet表达载体中,转化大肠杆菌 BL21,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达,并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件,以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化,以 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹鉴定蛋白的性质,对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率均在10%以上;重组蛋白存在于上清和沉淀中,经表达优化,在 IPTG终浓度为2 mmol/L、25℃、150 r/min振摇8 h诱导条件下,可增加可溶性蛋白的产率,纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶,活性可达136000 U/L,且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。结论通过密码子优化,成功构建了重组 AST的高效表达系统,重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。