肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响

目的探讨肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响。方法将60只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、肢体缺血预处理组(LIPC组)、3-甲基嘌呤组(3-MA组),每组15只。制作脑缺血再灌注、肢体缺血预处理及3-MA干预大鼠模型,在脑缺血2 h再灌注24 h后进行神经功能缺陷评分和脑梗死体积测定,HE染色观察细胞形态学改变,Western Bloting法检测自噬相关蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表达。结果与I/R组比较,LIPC组神经功能缺陷评分降低(P<0.05),脑梗体积明显减小(P<0.05),细胞损伤、坏死减轻(P<0.05),Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论 LIPC对缺血再灌注损伤大脑具有保护作用,其机制可能与减弱自噬水平有关。     

大鼠早期局灶性脑缺血再灌注损伤中USP10的表达水平变化及其与自噬的关系

目的 探讨早期局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型中再灌注不同时间点USP10的表达水平变化及其与自噬的关系。方法 将36只成年雄性SD大鼠随机分成4组:假手术组、脑缺血2 h再灌注6 h模型组、脑缺血2 h再灌注12 h模型组、脑缺血2 h再灌注24 h模型组; 采用线栓法致大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,给予神经行为学评分,用TTC染色法测定脑梗死体积,透射电镜观察梗死周边区皮层神经元自噬,Western blot 法检测梗死周边区皮层USP10和自噬相关蛋白LC3B的表达水平,免疫荧光双标法检测梗死周边区皮层神经元中USP10及LC3B的表达水平变化。结果 免疫荧光双标显示模型组自噬蛋白阳性细胞数与存活神经元数均于再灌注12 h最多(P<0.05),二者某种程度上趋势一致; Western blot免疫荧光双标均显示与假手术组相比,USP10及LC3B蛋白在模型组中表达上调(P<0.01),且于再灌注12 h组达到高峰(P<0.05); 透射电镜显示再灌注不同时间点自噬强度的变化与免疫荧光自噬蛋白表达水平的趋势基本一致。结论 早期脑I/R损伤中自噬的激活某种程度上可减轻神经元的损伤,而USP10可能通过某种机制调控脑I/R中自噬的发生发展。     

Beclin-1、LC3-Ⅱ在缺血后处理大鼠再灌注中的表达及意义

目的研究自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ在缺血后处理大鼠脑缺血再灌注海马中的表达及意义。方法根据Zea-Longa线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,将实验动物随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组、缺血后处理组,缺血后处理组再按不同缺血后处理时间分为15 s、30 s、1 min 3个亚组。缺血2 h再灌注24h后用免疫组织化学法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达情况,透射电镜观察神经细胞中自噬和溶酶体的激活以及细胞超微结构的变化。结果与缺血再灌注组相比,缺血后处理组神经行为学评分明显降低(P<0.05),脑梗死体积明显减小(P<0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达细胞数明显增加(P<0.01),自噬体形成和溶酶体激活量增加;缺血30 s亚组相比较15 s和1 min亚组上述指标(神经行为学评分除外)(P>0.05),差异亦有显著性(P<0.01)。结论脑缺血后处理的抗缺血再灌注损伤作用可能与上调自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达有关。     

大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马白噬相关蛋白LC3表达变化的研究

目的研究自噬微管相关蛋白轻链3（microtubule—associated protein 1 light chain3,LC3）在大鼠全脑缺血损伤后海马的表达情况,并探讨自噬在脑缺血损伤中的意义。方法使用四动脉结扎法制作大鼠全脑缺血模型再灌注损伤模型,实验动物随机分为：假手术组（sham组）、缺血再灌注纽。在全脑缺血15min后,分别再灌注0,30min,3,6,12,24h,1,3d,使用Westernblotting的方法检测各个时间点大鼠全脑缺血／复灌后海马LC3Ⅱ／LC3 Ⅰ蛋白的表达情况来研究脑缺血再灌注损伤后海马自噬现象的变化情况。结果与假手术组相比,大鼠全脑缺血再灌注损伤后3h,海马区LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白的表达开始上调,在全脑缺血再灌注损伤后1d表达最强（P〈0．05）。结论大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表达上调,表明脑缺血再灌注损伤后海马区域的自噬活性上调。     

缺血后处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤内质网应激通路相关分子的影响

目的探讨缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用及与内质网应激通路相关分子GRP78、caspase-12的关系。方法成年雄性Wistar大鼠58只,随机分为假手术组(sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)和缺血后处理组(IP组),采用线栓法阻断大脑中动脉制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注(MCAO)模型。大鼠脑缺血/再灌注后24 h进行神经行为学评分和脑梗死体积测定;脑缺血/再灌注6 h、12 h、24 h后免疫组织化学方法检测脑缺血侧半暗带区GRP78、caspase-12蛋白的表达。结果与缺血/再灌注组相比,后处理组再灌注24h神经行为学评分明显降低,脑梗死体积明显减少(P<0.05);后处理组再灌注12 h、24 h GRP78蛋白表达明显增加,再灌注24 h caspase-12蛋白表达明显减少。结论脑缺血后处理可能通过减弱内质网应激过程从而对随后发生的再灌注损伤起到了神经保护作用。其机制可能是增加GRP78蛋白表达、减少caspase-12蛋白表达而减轻神经细胞的凋亡。     

缺血后处理下调大鼠脑缺血再灌注时TLR4和NF-кB表达

目的探讨缺血后处理(IP)对大鼠局灶性脑缺血再灌注时Toll样受体4(TLR4)和核因子-кB(NF-кB)表达的影响。方法将110只成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术(sham)组(n=10)、缺血再灌注(I/R)组和后处理(IP)组,后两组根据再灌注的不同时间各分为6h、12h、24h、48h、72h 5个亚组(n=10)。建立局灶缺血再灌注和缺血后处理模型。观察大鼠的神经行为学评分、脑梗死体积、额顶叶皮层TLR4、NF-кB蛋白及mRNA表达情况。结果与I/R组相比,IP组大鼠神经行为学评分显著改善,脑梗死体积明显减少(P<0.05)。TLR4、NF-кB蛋白在I/R组和IP组的表达于再灌注6h时开始升高,24h达高峰。与I/R各相应亚组比较,IP各亚组TLR4、NF-кB蛋白表达均明显降低(P<0.05)。TLR4、NF-кB mRNA在I/R组和IP组的表达时间曲线与蛋白相一致。结论IP可通过抑制TLR4和NF-кB的表达,减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,改善神经功能。     

孕酮对大鼠脑缺血再灌注损伤后TASK3蛋白表达的影响

目的观察孕酮对大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠脑组织TASK3蛋白表达的影响,探讨孕酮对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组(I/R组)和孕酮+I/R组,后3组按缺血再灌注后不同时间随机分为0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h 8个亚组。线栓法建立大鼠右侧MCAO模型,缺血2 h再灌注24 h进行脑损伤评估,检测各组大鼠死亡率、神经功能缺陷评分以及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定脑梗死体积;采用免疫印迹法检测各组大鼠脑组织缺血2 h再灌注后不同时间点TASK3蛋白的表达。结果孕酮+I/R组大鼠死亡率(18.18%)明显低于I/R组(40.66%),该组动物脑梗死体积(21.85%±3.53%)也显著低于I/R组(37.21%±3.50%)(P<0.01),且该组神经功能缺陷评分(2.00±0.74)显著低于I/R组(2.67±0.49)(P<0.05)。与正常对照组相比,假手术组各时间点脑组织TASK3蛋白的表达无明显变化,而I/R组各时间点脑组织TASK3蛋白的表达均显著降低(P<0.05);与I/R组相比,孕酮+I/R组各时间点脑组织TASK3蛋白的表达显著升高(P<0.05)。结论孕酮对脑缺血再灌注损伤的大鼠具有脑保护作用,其机制可能与上调TASK3通道蛋白的表达有关。     

三七三醇皂苷对脑缺血再灌注大鼠的保护作用

目的 通过对局灶性脑缺血大鼠不同再灌注时段的动态观察．探讨三七三醇皂苷(PTS)对大鼠局灶性脑缺血／再灌注动物模型的神经行为学和脑梗死体积的保护作用。方法 采用改良的线栓法制备大脑中动脉阻塞(MACO)2h、再灌注不同时间段(3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d)的大鼠短暂局灶性脑缺血模型。动物随机分假手术组、生理盐水对照组、三七三醇皂苷(PTS)组。用Zea Longa5分制评分和TTC染色法评价神经行为学和脑梗死体积。结果 神经行为学评分除72h组有明显改善外．其余各组与生理盐水对照组比较无显著性差异。脑梗死体积除再灌注3h、6h外．其余各组与生理盐水组比较差异均有显著性意义。结论 三七三醇皂苷对大鼠局灶性脑缺血及再灌注损伤有一定的保护作用。     

缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白43的影响

目的 观察缺血后处理对脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白43(Cx43)的影响.方法 30只Wistar雄性大鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、缺血后处理(IP)组.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,脑缺血2h后,I/R组予再灌注,IP组给予大脑中动脉血流再通30s,之后阻断血流30s,如此进行3个循环之后予永久再灌注.于脑缺血再灌注后24h行TTC染色观察脑梗死体积、神经功能缺损评分,应用激光共聚焦显微镜观察Cx43蛋白表达量及分布的变化,行各组间比较.结果 IP组脑梗死体积明显小于I/R组,IP组神经缺损评分低于I/R组,与Sham组相比,I/R组Cx43数量明显减低、分布紊乱,IP组Cx43表达数量及分布明显好于I/R组.结论 缺血后处理可减小脑梗死体积、减轻神经功能缺损,缺血后处理能抑制Cx43表达减少、改善Cx43分布情况.     

电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后EAAT2的表达研究

目的研究电针预处理对脑缺血再灌注损伤后大鼠缺血半暗带兴奋性谷氨酸转运体2(EAAT2)表达的影响,探讨EAAT2在电针预处理诱导脑缺血耐受中的作用。方法 18只SD雄性大鼠随机分为3组(n=6):分别为假手术(Sham)组、右侧大脑中动脉阻闭(MCAO)组、电针预处理(EA)组。假手术组仅分离血管,不进行阻闭,术后24 h检测;MCAO组用MCAO法致缺血120 min后于再灌注24 h检测;EA组大鼠予电针刺激30 min,刺激结束2 h后处理同MCAO组。3组大鼠在观察神经行为学变化后取材,通过2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染色评估梗死面积,并检测EAAT2 mRNA及蛋白表达水平。结果电针预处理能明显降低脑梗死容积百分比(P0.01),提高MCAO大鼠神经行为学评分,诱导脑缺血耐受并抑制脑缺血再灌注损伤后24 h EAAT2表达的下降(P0.01)。结论脑缺血再灌注损伤后,EAAT2表达下降,而电针预处理能显著抑制缺血半暗带EAAT2的表达下调,诱导脑缺血耐受,从而减轻脑缺血再灌注损伤。     

氧化应激对脑缺血再灌注损伤后自噬调控机制

目的研究小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后早期自噬的变化和活性氧调控自噬的作用机制。方法线栓法制作小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型56只,随机分成假手术组,对照组（仅建立tMCAO损伤）、tMCAO＋N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）组和tMCAO＋雷帕霉素组。Western blotting检测皮质和纹状体再灌注后不同时间点（再灌注后1、3、6、12、24 h）自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin-1的表达。双氢溴乙啶染色检测细胞内活性氧水平及对自噬活性的影响,免疫荧光染色观察NAC或雷帕霉素诱导下的自噬变化。2,3,5-氯化三苯四氮唑染色观察脑梗死面积的变化。结果与假手术组比较,缺血再灌注损伤后1 h Beclin-1开始升高,6 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达上调。与对照组对比,NAC条件下LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1表达趋势明显升高。缺血再灌注损伤后1 h活性氧开始升高,给予NAC后表达下降。在NAC和雷帕霉素干预下,梗死面积缩小。结论小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬表达上调,活性氧水平升高,抗氧化剂可能通过激活细胞的自噬途径保护神经细胞,减小脑梗死面积。     

人参皂甙-Rd预先给药对大鼠脑的保护作用

目的探讨人参皂甙-Rd（Rd）预先给药对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法雄性SD大鼠70只,随机分为7组（n=10）,即缺血再灌注组（CON组）、Rd 5 mg组、Rd 10 mg组、Rd 20 mg组、Rd 40 mg组、Rd 80 mg组和丙二醇溶剂组（VEC组）。所有大鼠均采用右侧颈内动脉尼龙线栓法制作大脑中动脉阻塞（MCAO）模型,并于脑缺血前1 h分别经腹腔注射相应剂量Rd及丙二醇。于再灌注后24 h、48 h和72 h进行神经行为学评分（NBS）,并于72 h行2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测量脑梗死容积百分比。结果与CON组和VEC组比较,Rd 5 mg组、Rd 10 mg组、Rd 20 mg组、Rd 40 mg组和Rd 80 mg组脑缺血再灌注后24 h、48 h、72 h神经行为学评分均较高,再灌注后72 h梗死容积均较低（P〈0.05）。Rd剂量小于40 mg/kg时,其保护效果随剂量的增加而增加。Rd 80 mg组与Rd 20 mg和Rd 40 mg组相比,NBS显著减小,脑梗死容积百分比明显升高（P〈0.05）;与Rd 5 mg组和Rd 10 mg组相比,NBS和脑梗死容积百分比均无明显差异（P〉0.05）。结论人参皂甙-Rd预先给药对大鼠短暂局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,并在5-40 mg/kg之间存在剂量依赖性的保护作用。     

KATP开放剂对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

目的观察ATP敏感性钾通道（KATP）开放剂尼可地尔（nicorandil）对大鼠脑缺血／再灌注（I／R）损伤的保护作用及其机制。方法将60只雄性Wistar大鼠随机分为4组：A组（假手术组）、B组（脑缺血再灌注组）、C组（脑缺血再灌注＋尼可地尔组）及D组（脑缺血再灌注＋尼可地尔＋5-HD组），采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，各组于脑缺血2h后进行再灌注，再灌注22h后观察各组大鼠神经功能评分、脑梗死体积、线粒体标志酶活性和脂质过氧化降解产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。结果（1）B、C、D组再灌注22h后神经功能评分显著低于A组，脑梗死体积、脂质过氧化物MDA含量均显著高于A组，线粒体标志酶活性SDH、CO表达显著低于A组（P〈0.01）；（2）与B、D组比较，C组神经功能评分明显升高，脑梗死体积、MDA含量明显减少，SDH、CO活性明显增高（P〈0.01）；（3）B组和D组各指标之间比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论尼可地尔对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与开放mitoKATP通道、维护线粒体功能、减少氧自由基产生有关。     

2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的初步观察

目的：初步观察咪唑啉I2受体的高选择性配体2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-BFI）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。方法：建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型。在脑缺血后即通过大鼠尾静脉给予生理盐水、2-BFI或咪唑克生。通过2,3,5-三苯基氯化四唑染色检测梗死体积并评价大鼠的神经功能缺损。通过免疫组化方法检测caspase-3蛋白和原位细胞凋亡法检测缺血半暗带中凋亡神经细胞数。结果：在局灶性脑缺血24h后,2-BFI和咪唑克生都能够显著提高神经功能评分。给予2-BFI或咪唑克生都可以显著降低梗死体积、减少caspase-3阳性细胞数（P〈0．01）和凋亡细胞数（P〈0．05）。结论：2-BFI和咪唑克生对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠有神经保护作用,为脑卒中的治疗提供了新的治疗方法。     

依托咪酯预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用

目的 探讨依托咪酯预处理对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法 18只雄性SD大鼠,随机均分为3组,即脑缺血-再灌注组、依托咪酯预处理组、脂微球对照组。采用颈内动脉线栓栓塞致大脑中动脉阻塞模型,监测肛温及血糖,并于再灌注24h后断头处死动物,取大脑切片行2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色,测量并计算脑梗死容积百分比。结果 依托咪酯预处理组脑梗死百分比明显低于脂微球对照组（P＜0.01）,低于缺血-再灌注组（P＜0.05）。但缺血-再灌注组与脂微球对照组相比差异无统计学意义。结论 依托咪酯预处理后可明显减小大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后的脑梗死面积。     

黄芪注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的 探讨黄芪注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用和机制.方法 应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO/R）模型,经腹腔注射黄芪注射液（3 ml/kg）干预治疗.Longa法评价大鼠神经行为功能,氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察脑梗死体积,苏木精-伊红（HE）染色观察海马神经元形态结构,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化检测c-jun氨基末端激酶（JNK3）蛋白表达水平.结果 经黄芪注射液治疗后大鼠海马神经元JNK3蛋白表达水平显著降低,凋亡细胞数量显著减少,神经元形态恢复,脑梗死体积缩小,大鼠神经行为功能显著改善.结论 黄芪注射液可通过下调JNK3表达水平而抑制细胞凋亡,缩小脑梗死体积,改善大鼠神经行为功能.     

β-七叶皂甙钠对大鼠脑缺血-再灌注损伤炎症反应的影响

目的探讨β-七叶皂甙钠对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法45只Wistar大鼠随机平均分为假手术组、生理盐水对照组和β-七叶皂甙钠治疗组。线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉,制备局灶性脑缺血-再灌注模型,在脑缺血2h、再灌注24h后,分别对各组大鼠的神经行为学变化评分,对缺血区白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子（TNF-α）进行测定和分析。结果在脑缺血2h再灌注24h后治疗组与对照组相比,前者行为学评分优于后者（P〈0.05）,IL-1β和TNF-α含量降低（P〈0.05）。结论炎症反应参与了脑缺血-再灌注损伤,β-七叶皂甙钠可以降低缺血-再灌注后脑组织中的IL-1β和TNF-α含量,减轻梗死体积,减轻炎症反应,对局灶性脑缺血-再灌注损伤可能具有一定的保护作用。     

Autophagy inhibitors 3-MA and BAF may attenuate hippocampal neuronal necroptosis after global cerebral ischemia–reperfusion injury in male rats by inhibiting the interaction of the RIP3/AIF/CypA complex

Our previous study found that receptor interacting protein 3 (RIP3) and apoptosis-inducing factor (AIF) were involved in neuronal programmed necrosis during global cerebral ischemia–reperfusion (I/R) injury. Here, we further studied its downstream mechanisms and the role of the autophagy inhibitors 3-methyladenine (3-MA) and bafilomycin A1 (BAF). A 20-min global cerebral I/R injury model was constructed using the 4-vessel occlusion (4-VO) method in male rats. 3-MA and BAF were injected into the lateral ventricle 1 h before ischemia. Spatial and activation changes of proteins were detected by immunofluorescence (IF), and protein interaction was determined by immunoprecipitation (IP). The phosphorylation of H2AX (γ-H2AX) and activation of mixed lineage kinase domain-like protein (p-MLKL) occurred as early as 6 h after reperfusion. RIP3, AIF, and cyclophilin A (CypA) in the neurons after I/R injury were spatially overlapped around and within the nucleus and combined with each other after reperfusion. The survival rate of CA1 neurons in the 3-MA and BAF groups was significantly higher than that in the I/R group. Autophagy was activated significantly after I/R injury, which was partially inhibited by 3-MA and BAF. Pretreatment with both 3-MA and BAF almost completely inhibited nuclear translocation, spatial overlap, and combination of RIP3, AIF, and CypA proteins. These findings suggest that after global cerebral I/R injury, RIP3, AIF, and CypA translocated into the nuclei and formed the DNA degradation complex RIP3/AIF/CypA in hippocampal CA1 neurons. Pretreatment with autophagy inhibitors could reduce neuronal necroptosis by preventing the formation of the RIP3/AIF/CypA complex and its nuclear translocation.