SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR~ GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBRGreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYBRRGreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高,检测低限为19CFUml。该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术,利用SYBRGreenI染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBRGreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR Green实时荧光PCR检测食品中鲨鱼源性成分真实性方法的建立

为确保鲨鱼产品的真实性,作者研究建立了食品中鲨鱼源性成分的SYBR Green实时荧光PCR鉴定方法.运用建立的SYBR Green实时荧光PCR方法对9种鲨鱼及48种常见非鲨鱼类动植物样品进行检测,9种鲨鱼样品均出现扩增曲线,且熔解曲线在(84±1.5)℃内出现峰值;其他非鲨鱼样品中均未出现扩增曲线,熔解曲线在(84±1.5)℃也未出现峰值.该检测方法的检测限为0.0001 ng/μL鲨鱼DNA和质量分数0.01％狗鲨肉粉.运用建立的方法对20种常见的鲨鱼产品进行PCR检测,除仿鱼翅和鲨鱼肝油外所有产品中均能检测出鲨鱼成分.结果表明,该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别.     

葡糖杆菌的SYBR Green Ι荧光定量PCR方法的建立

基于Gen Bank提供的葡糖杆菌的16S r RNA保守序列设计PCR引物,利用SYBR GreenΙ荧光定量PCR技术建立一种快速灵敏检测酸乳制品中葡糖杆菌的方法。用本研究建立的SYBR GreenΙ荧光PCR方法对3株葡糖杆菌以及18株非葡糖杆菌进行特异性检测,并用凝胶电泳验证其可靠性,结果显示,本研究所设计的引物具有良好的特异性。对扩增结束后的PCR产物进行溶解曲线分析,证实此引物的扩增产物存在引物二聚体,但可通过溶解曲线的出峰时间排除非特异性扩增。利用SYBR GreenΙ荧光定量PCR检测葡糖杆菌建立的标准曲线相关性良好,R2=0.9968,对葡糖杆菌进行灵敏度检测,最低检出限可达75 CFU/m L。利用该方法可成功检测出5份人工污染样品中的葡糖杆菌,研究表明,该方法灵敏度高、操作简便快捷,适用于酸乳制品的定量检测。     

植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法

根据已报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法,对其特异性和灵敏度进行了评价,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。结果显示,该方法对2株植物乳杆菌能得到阳性扩增,其余11株乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,灵敏度高达0.001 ng/μL,而且在退火温度为50~60℃范围内不影响其特异性,表明该方法对退火温度不敏感;用微生物菌制剂和酸奶共13种益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。因此,该研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够快速、准确、高效地检测微生物菌制剂及其他益生菌产品中的植物乳杆菌。     

副溶血弧菌的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法建立

基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列设计1对特异性引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR的Tm为90℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性;所制作的实时定量PCR扩增标准曲线在2.06×108～2.06×103拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.992,能对副溶血弧进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,且较传统方法敏感、操作简单,可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

荧光定量PCR方法快速检测原料乳中的大肠杆菌

利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR技术建立一种快速检测原料乳中大肠杆菌数量的方法.根据大肠杆菌的ITS保守序列设计特异性引物,应用常规PCR方法确定引物特异性,然后优化SYBR Green Ⅰ的添加量和Mg2+的额外添加量,确定对原料乳中大肠杆菌的最低检测限.结果表明,引物具有很强的特异性,最终确定的SYBR Green Ⅰ(20×)的添加量为0.75 μL,Mg2+的额外添加量为0.875 mmol/L;在不增菌的前提下,对原料乳中大肠杆菌的最低检测限为1.7×103 mL-1.检测的10份样品中有四份样品的大肠杆菌数超过103 mL-1,与平板菌落计数结果无显著差异.该方法特异性强,灵敏度高,操作简便快捷,整个检测过程仅需3 h,具有较大的推广及应用价值.     

应用SYBR Green Ⅰ溶解曲线检测食源性单增李斯特菌

基于单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物,确立SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测单增李斯特菌两个特异性基因的最佳反应体系及条件,反应液经凝胶电泳验证,验证结果显示,扩增出的两条不同大小、不同Tm值的目的核酸片段,分别对应两条荧光PCR溶解曲线上的两个独立波峰.基于单增李斯特菌hlyA基因建立标准曲线,相关系数为0.996,最低检出限约为89CFU/mL.为检验方法的可行性,对鲜活白蚬子样品中分离出的疑似菌株进行实际检测,所得阳性结果经国家标准方法(GB 4789.30-2010)验证,验证结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光PCR实际检测阳性结果与GB 4789.30-2010检测结果一致.     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

太平洋无须鳕鱼及其制品的PCR鉴定

目的建立一种SYBR Green荧光PCR法定性检测太平洋无须鳕鱼成分的分析SYBR Green荧光PCR定性检测方法。方法根据太平洋无须鳕鱼线粒体细胞色素氧化酶CoxⅠ基因中的保守基因序列设计一对太平洋无须鳕鱼特异性引物,通过SYBR Green荧光PCR法进行PCR扩增反应,可对DNA提取试剂盒提取的太平洋无须鳕鱼成分DNA进行特异性检测。结果该SYBR Green荧光PCR定性检测方法的引物对于太平洋无须鳕鱼成分的检测特异性良好;方法的灵敏度分别为0.06 ng/μL太平洋无须鳕鱼DNA和质量分数为0.01%太平洋无须鳕鱼肉粉。通过对市售太平洋无须鳕鱼片、太平洋鳕鱼片和太平洋无须鳕鱼肝油的检测,该方法可检测出鱼片中的太平洋无须鳕成分。结论该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中太平洋无须鳕鱼成分的真实性鉴别。     

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR的快速检测

本文运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中常见的乳酸杆菌进行检测的快速方法.针对乳酸杆菌16S rDNA序列,设计了通用引物和特异性探针,进行TaqManTM实时PCR检测,以非同源性参考菌株做特异性检测;把乳酸杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.实验结果表明用实时荧光PCR法检测乳酸杆菌,快速、敏感、特异性高.     

两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分

采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测.结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL.本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础.     

马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种real-time PCR检测方法的建立与应用

本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立real-time PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性和混合体系等进行检测。结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,建立real-time PCR的标准曲线,其决定系数R2为0.965,具有良好的线性关系,且在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种及混合体系中可以特异性检出。综上,本研究建立的real-time PCR法可以快速、准确地检测马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种,为马乳酒样乳杆菌的特异性定性定量检测提供了一种新的方法。     

H-NS基因作为靶基因的荧光定量PCR快速检测海产品中的副溶血性弧菌

目的:建立一种利用SYBR Green I荧光PCR反应快速、准确、便捷检测副溶血性弧菌的方法。方法:根据副溶血性弧菌的H-NS基因的保守区域设计引物,利用副溶血性弧菌的标准菌株以及12株其他种属的常见致病菌对引物的特异性和灵敏度进行评价。基于该基因利用SYBR Green I荧光PCR检测方法建立标准曲线,确定该检测方法的灵敏度。对用不同浓度的菌液污染的灭菌过的蚬子样品进行检测,确定该方法的的可行性。最后用该方法检测30份蚬子样品,并与国标GB4789.7-2013检测结果进行比较。结果:用H-NS基因作为靶基因检测副溶血性弧菌的SYBR Green I荧光PCR检测方法,建立的标准曲线的相关系数为0.998,检测灵敏度为7.3×10 CFU/m L。人工污染蚬子的检出限为6.7×102CFU/m L。对蚬子样品的检测结果为30份样品中有4份含有副溶血性弧菌,与国家标准方法 (GB4789.7-2013)的检测结果具有一致性。结论:表明该方法可以用于副溶血性弧菌的快速检测。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

原料乳中志贺氏菌的实时荧光环介导等温扩增技术研究

为了建立原料乳中志贺氏菌快速检测的有效方法,提高志贺氏菌的检出效率。研究根据Gen Bank中志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipa H),设计特异性LAMP引物,将SYBR GreenⅠ荧光染料结合到LAMP扩增技术中,通过实时荧光监测仪优化Mg~(2+)、d NTPs、温度和引物等反应条件,建立了实时荧光环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的反应体系,对纯菌的菌悬液及原料乳人工污染样品中的志贺氏菌进行检测,并对该检测方法的特异性、灵敏度进行了研究,并与普通的LAMP检测方法进行比较。结果表明,该检测方法特异性强灵敏度高,纯菌的菌悬液灵敏度和人工污染样品的检出限都能够达到100 cfu/m L,且灵敏度高于普通的LAMP检测方法。综上所述,研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短,且检测结果直观易于分析,适用于快速准确监测原料乳中志贺氏菌的污染情况。     

建立一种快速鉴定欧鳇及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

根据欧鳇线粒体细胞色素氧化酶CoxⅠ基因中的保守序列设计欧鳇特异性引物,建立欧鳇成分SYBR Green荧光PCR定性检测方法。该方法的引物对于欧鳇成分的特异性良好,方法的灵敏度为0.04 ng/μL欧鳇DNA和质量分数0.01%欧鳇肉粉。通过对市售鱼子酱检测,显示该方法可检测出鱼子酱中的欧鳇成分。结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高,能够用于食品中欧鳇源性成分的真实性鉴别。