基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性。方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性。收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列。知母psbA-trnH序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支。共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides。结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定。所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

市售白花蛇舌草药材的DNA条形码鉴定研究

目的:基于ITS2序列检测市场药材白花蛇舌草,为白花蛇舌草药材鉴定提供一种新的分子手段。方法:实验获取白花蛇舌草及其常见混伪品基原植物ITS2序列,结合Gen Bank下载序列共7个物种53条序列。经Codon Code Aligner V3.7.1拼接,利用MEGA 6.0软件进行变异位点分析,遗传距离计算和构建邻接(NJ)系统发育聚类树。同时随机检测37份市场药材白花蛇舌草,经中药材DNA条形码鉴定系统进行序列比对并构建邻接(NJ)系统聚类树确定物种,鉴别真伪。结果:白花蛇舌草基原植物ITS2序列种内K2P平均遗传距离远小于其与混伪品种间K2P平均遗传距离,NJ树结果表明白花蛇舌草基原植物可与其混伪品明显区分;市场药材中正品29份,伪品8份,其中半枝莲和远志为新发现的伪品。结论:基于ITS2序列DNA条形码技术可有效准确鉴定白花蛇舌草及其混伪品,为其用药安全提供了有力保障。     

基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定

山豆根是我国常用中药材,对山豆根基原植物及其易混伪品进行DNA分子鉴定研究具有重要意义。本文对5科9属38个物种84份山豆根基原植物及其混伪品样品的ITS2序列进行序列变异分析、K-2p遗传距离比较及NJ系统发育聚类树构建。结果表明所研究山豆根基原植物样品种内ITS2序列无变异,与其同属密切相关物种的ITS2序列变异位点为102个,平均K-2p遗传距离为0.072,与其他混伪品的ITS2序列变异位点为200个,平均K-2p遗传距离为0.594。山豆根基原植物在NJ系统发育聚类树上聚为一支,支持率为98。因此,ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区分山豆根基原植物及其混伪品,为山豆根药材及其混伪品的鉴定提供基础。     

市售中药材冬葵子和苘麻子ITS2条形码鉴定

目的利用ITS2条形码序列对市售中药材冬葵子、苘麻子进行分子鉴定,以保证药材使用的正确性和临床药效。方法收集冬葵子、苘麻子及其3种混伪品样品共87份。对实验样品进行ITS2基因片段扩增并双向测序,利用HMMer注释方法获得ITS2序列,再经Codon Code Aligner 6.0.2拼接,使用MEGA6.0进行种内、种间变异分析,遗传距离计算并构建NJ系统发育树;将所得序列转换成二维码图片,扫描识读后通过中药材DNA条形码数据库进行验证。结果冬葵子和苘麻子外观形态相似;冬葵子ITS2序列长度232 bp;GC量为67.6%;苘麻子ITS2序列长度231 bp,GC量为54.1%,二者均无种内变异。冬葵子和苘麻子ITS2序列比对后长度为233 bp,共存在50个变异位点。鉴定结果显示,收集的56份冬葵子药材中26份均为苘麻子,剩余30份为正品。冬葵子和苘麻子与其他3个混伪品的K2P遗传距离为0.224~0.868,平均距离为0.630,种间遗传距离远大于种内遗传距离。基于ITS2序列构建系统发育树可见冬葵子、苘麻子及其3个混伪品各自单独聚成一支,ITS2序列能够明显将其区分;此外,使用二维DNA条形码扫描可准确验证5个物种。结论 ITS2序列能够成功鉴定冬葵子、苘麻子及其常见混伪品,为种子类药材鉴别提供了新工具;二维码技术与DNA条形码技术的结合可以为药材的基原物种提供准确唯一的二维DNA条形码信息,可更好实现药材市场的信息化监管。     

基于ITS2条形码鉴定水红花子及其混伪品

目的:利用ITS2条形码对中药材水红花子及其混伪品进行鉴定研究。方法:为对该中药材进行准确鉴定,共收集71份样本,包含药材正品及其混伪品。通过对样品进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,利用Codon Code Aligner软件进行序列质量评价与拼接,获得ITS2序列。用MEGA软件进行序列比对、变异位点及遗传距离分析,采用最近距离法和构建NJ(邻接)树法来评价ITS2条形码的鉴定能力。结果:水红花子药材基原物种红蓼ITS2序列种内遗传距离为0~0.0124,与其混伪品水蓼、酸模叶蓼以及春蓼的种间遗传距离分别为0.0334~0.0508、0.0688~0.0875、0.0379~0.0467。红蓼种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定水红花子与其混伪品。此外,基于ITS2序列构建的NJ树也可将水红花子及其混伪品明显区分开。结论:ITS2条形码是鉴别水红花子药材的有效工具,可为保障该药材生产投料安全提供新的技术手段。     

基于DNA条形码技术的中药材木通种子鉴定研究

目的:利用核糖体内部转录间隔区2(ITS2)及叶绿体psbA-trnH序列对中药材木通种子进行鉴定,建立其种子DNA条形码鉴定方法,保障中药材木通种子的准确性。方法:收集木通种子样品15份,通过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增、双向测序,获取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、邻接(NJ)系统发育树构建进行物种鉴定分析。结果:共获得4种类型ITS2序列,2种类型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可区分木通与川木通、关木通,但ITS2序列可以区分木通与三叶木通、白木通,psbA-trnH序列无法区分木通与三叶木通、白木通。结论:DNA条形码技术可用于木通种子及其易混伪品的鉴定。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。     

基于DNA条形码的中药材种子种苗鉴定研究——以重楼为例

目的:以重楼为例,探讨DNA条形码技术在中药材种子种苗鉴定中的应用,为中药材种子种苗基原物种鉴定提供技术参考。方法:采用DNA条形码技术,建立重楼中国药典物种标准条形码数据库,通过序列比对、遗传距离比较和系统NJ树构建,研究DNA条形码在种子种苗鉴定中的应用。结果:云南重楼和七叶一枝花种内遗传距离分别小于种间遗传距离,ITS条形码可有效鉴别正品重楼及其混伪品的种子种苗。结论:DNA条形码技术是中药材种子种苗鉴定的有效手段,应用前景广阔。     

基于ITS2条形码及其二级结构的菊科药用植物的系统发育分析＊

目的 采用ITS2（Internal transcribed spacer2，内转录间隔区2）序列作为条形码技术对菊科药用植物进行鉴别。方法 选取来自西藏及四川康定、乐山和峨眉地区的菊科样品44种，提取DNA并对其进行PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增，后测序，测序结果提交至GenBank；同时从GenBank上下载17条样本序列。对提交和下载的61条序列用MEGA7.0软件计算种内与种间的遗传距离，采用邻接法（neighbor-joinging，NJ）构建系统聚类树直观反应鉴定结果。从ITS2数据库中预测并比较样本ITS2序列的二级结构差异。结果 菊科植物种间最小遗传距离0.031大于种内最大遗传距离0.009，有较明显的barcoding gap；NJ树显示种各属样本分别聚为一大枝，种内之间各自聚成小支，表现出良好的单系性；各属及各种样品ITS2二级结构存在明显差异。结论 以ITS2序列作为DNA条形码，能够对菊科药用植物进行准确、迅速的识别与鉴定，是物种间进化关系准确的分子鉴定依据，可为该科植物的分布、种群及种群数量的研究提供指导，为控制药品质量、合理开发利用及保护提供了新手段。     

基于ITS2序列的5种鬼臼类中药材DNA条形码鉴定研究

目的通过分析5种鬼臼类中药材八角莲、南方山荷叶、桃儿七、小八角莲和六角莲的ITS2(internal transcribed spacer2)条形码序列,探讨鬼臼类药材鉴定新方法。方法共收集26份样品,以ITS2作为条形码序列,对各鬼臼类中药材提取基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并进行双向测序。所得序列经Codon Code Aligner拼接并剪切后,采用MEGA5.1软件进行序列对比分析,计算遗传距离,分析比较种内、种间序列差异,并构建系统邻接树。结果 5种药材种间存在明显差异,各个种的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离;构建的系统树各个种不同样本均分别聚在一起,表现出单系性。结论ITS2序列作为DNA条形码可较好地用于鬼臼类中药材DNA条形码的鉴定研究。     

应用种子形态及DNA条形码技术鉴定黄芪及混伪品种子

目的 采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术对黄芪及混伪品种子进行鉴定。方法 收集黄芪及混伪品种子、市售黄芪种子样品共58份,利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重;提取单粒种子的基因组DNA,PCR扩增、双向测序获得ITS2及psbA-trnH序列。使用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,kimura二参数（kimura two-parameter,K2P）模型计算遗传距离,进行物种鉴定分析。结果 黄芪及混伪品种子在颜色、形状、长、宽、厚度及千粒重等方面存在细微差别;ITS2的测序成功率为100%,黄芪种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离;ITS2序列构建的NJ系统进化树将蒙古黄芪A.mongholicus var. mongholicus聚为独立一支,并将蒙古黄芪Astragalus membranaceus、紫花苜蓿Medicago sativa、锦鸡儿Caragana sinica、蜀葵Althaea rosea及黄芪属其他物种分开,可进行黄芪及其混伪品种子的鉴定。基于外观形态和ITS2条形码序列鉴定发现12份市售黄芪种子中有1份为斜茎黄芪。结论 基于种子形态鉴定和ITS2条形码相结合的方法可以准确鉴定黄芪及混伪品种子,为规范黄芪种源及种植生产,进而保障黄芪药材质量提供科学依据。     

基于DNA条形码的玉叶金花属植物鉴定研究

目的利用DNA条形码进行玉叶金花属植物的分子鉴定。方法对玉叶金花属20种、89份个体进行叶绿体片段rbc L、mat K和trn H-psb A以及核基因片段ITS的PCR扩增和测序,计算种内和种间Kimura 2-parameter(K2-P)遗传距离,利用序列相似性法和邻接法进行单一片段、核心片段、组合片段以及ITS2片段的分析。结果单一片段分析结果表明玉叶金花属种间遗传距离(0.002~0.012)明显大于种内遗传距离(0.000 3~0.000 7)。trn H-psb A扩增率最低,ITS2片段的分辨率最高,其次是mat K和ITS片段,rbc L片段的分辨率最低。片段组合后的分辨率明显提高,基于序列相似性法和邻接法,mat K+rbc L+ITS和mat K+rbc L+trn H-psb A+ITS的分辨率相当,且比其他片段组的分辨率更高,分别为77%和75%,成功鉴定了15个近缘类群,包括2个药用种类广西玉叶金花和黐花。结论鉴于trn H-psb A扩增率较低,建议mat K+rbc L+ITS作为玉叶金花属物种鉴定的DNA条形码,并作为其药用种类的分子鉴定工具。     

基于ITS2序列的中药材苍术种苗DNA条形码鉴定

目的:建立基于DNA条形码技术的中药材苍术种苗鉴定方法。方法:收集中药材苍术及其易混品原植物样品28份,构建苍术种苗鉴定参考核糖体内部转录间隔区2(ITS2)条形码数据库。从河北、山东、山西、内蒙古、辽宁及湖北等苍术主产地收集苍术种苗52份。通过提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序获得其ITS2条形码序列。应用PUAP 4.0软件计算种内、种间遗传距离,利用MEGA 7.0软件构建邻接树,对中药材苍术种苗进行DNA条形码鉴定。结果:中药材苍术及其易混品原植物ITS2条形码序列具有稳定的序列差异,邻接树呈现单系性,可以明显区分苍术及其易混品;基于标准参考数据库,42份苍术种苗为朝鲜苍术(80.8%),7份苍术种苗为苍术(13.5%),3份苍术种苗为白术(5.7%)。结论:基于ITS2序列可以准确区分中药材苍术及其混伪品种苗。苍术种苗基原物种鉴定结果以朝鲜苍术为主,提示苍术临床用药存在潜在安全风险。     

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列。方法采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100%。比对后序列长度为255~723 bp,GC量范围为30.6%~68.2%。psbA-trnH基因序列的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap。基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定。结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列。     

基于ITS条形码标记对当归属药用植物的鉴别

目的利用ITS条形码标记技术对当归属药用植物进行鉴别。方法选取该属32个物种158条核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行分子鉴别分析。所得序列运用MEGA 6.0软件计算种内和种间遗传距离,同时分别构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ)、最大似然树(maximum-likelihood tree,ML)和最大简约树(maximum-parsimony tree,MP),分析ITS序列的鉴别能力和当归属药用植物种间的系统发育关系。结果当归属物种间ITS序列最小遗传距离大于种内最大遗传距离,而且系统发育结果显示,每个物种的ITS基因型序列能较好地聚类为对应于该物种本身的分支,且具有中到高度的支持率,说明ITS序列能够将当归属物种区分开。结论 ITS序列可以作为当归属药用植物的DNA分子条形码标记,将在该属物种的分子鉴定方面发挥重要潜力。     

基于ITS2序列的茄科酸浆属植物的DNA分子鉴定

目的:利用内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对茄科酸浆属植物进行分子鉴定。方法:对酸浆属与散血丹属植物样本的ITS2序列进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增和测序。为扩大研究范围,从Gen Bank中下载了上述2个属植物样本的ITS2序列。所有序列经Codon Code Aligner V3.0.1软件拼接,DNAMAN软件比对分析,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建邻接聚类树。从ITS2数据库中获得所测样本及下载序列的ITS2二级结构信息,分析各样本间ITS2序列二级结构的差异。结果:从邻接聚类树分析可知,所有样本被聚为两大支。酸浆属植物自成1支,散血丹属植物为1支,且除极个别样本外,2个属的各物种种内样本可各为1支,表现出单系性;且每2支之间的Bootstrap支持率均很高。结论:ITS2序列在近缘物种间的系统学研究、品种的鉴定方面具有较大的应用潜力,适用于酸浆属植物的分子鉴定。