野生种马铃薯PHYA基因cDNA的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯（Solanum pinnatisectum Dun）中克隆到1个光敏色素基因PHYA,其cDNA全长为3466bp,含有一个3 372bp的完整开放阅读框,编码一条长1123个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5．8-该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草基因编码的氧基酸序列同源性分别为96％、94％和91％。半定量RT-PCR分析表明,PHYA在根、茎和芽中的表达量较高;光对PHYA表达的作用在地上部器官中表现为抑制,而在地下部器官中则促进。     

野生茄子(Solanum torvum)抗黄萎病相关基因StoVe1的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVe1,其cDNA全长3 400bp,含有3 153 bp的完整开放阅读框,编码1 051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Ve1编码的氨基酸序列同源性分别为82%、81%和80%,且有很高的功能区段保守性.将该cDNA全长序列提交GenBank,登陆号为DQ020574.半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少.     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析

采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯（Solanum cardiphyllum）分离得到了一个花色素合成酶（anthocyanidin synthase）同源基因ScANS的cDNA（GenBank登录号HQ701726）和DNA序列（GenBank登录号HQ701727）。序列分析表明,ScA册基因全长为1583bp,由一个内含子和两个外显子组成,开放阅读框长度为1365bp,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白分子量为51．10kDa,理论等电点为5．24。ScANS含有典型的20G—FeII-Oxy保守功能域,属于2-OOD酶家族,其氨基酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高,达82．86％。组织表达分析表明,SScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高水平的转录表达,在根中有微量表达,在匍匐茎和块茎中检测不到。     

丽蝇蛹集金小蜂气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

利用RACE技术,首次从丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis中克隆获得一个气味结合蛋白全长cDNA序列.该基因全长553 bp,开放阅读框411 bp,3'和5'端非编码序列分别为13 bp和129 bp.其推导的氨基酸序列编码136个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为15.4 kDa,等电点为8.76.同源性比对分析发现,丽蝇蛹集金小蜂气味结合蛋白基因与现已报道的其它昆虫气味结合蛋白基因在氨基酸水平上的相似性均低于30%,拥有6个保守半胱氨酸位点等气味结合蛋白所具有的典型特征.系统进化树分析表明,丽蝇蛹集金小蜂气味结合蛋白与意大利蜜蜂Apis mellifera气味结合蛋白2,3,4,5,6,7,8和12聚为同一族,与意大利蜜蜂气味结合蛋白5,6和8的进化程度最近.RT-PCR分析表明,丽蝇蛹集金小蜂气味结合蛋白基因不仅在雌、雄成虫触角中高度表达,而且在头部和足中有微弱表达.     

枸杞蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及组织表达分析

利用RT-PCR及RACE技术,从药用植物枸杞中克隆了1个编码蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA,命名为LbSPS(GenBank登录号KC834608)。序列分析表明:LbSPS基因长3 677bp,开放阅读框为3 165bp,编码1 033个氨基酸,分子量为118.457 5kD,理论等电点6.05。系统进化分析显示,LbSPS编码的氨基酸序列与甜瓜、马铃薯、番茄等蔗糖磷酸合成酶基因编码氨基酸序列一致性为66%~98%。qRT-PCR分析显示,LbSPS基因在枸杞花中表达量最高,叶中表达水平较低。该研究为进一步了解LbSPS在枸杞生长发育、逆境胁迫等过程中的生物学功能奠定了基础。     

猪CuZnSOD基因的克隆、表达及功能分析

为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用RACE(Rapid amplification of cDNA end)方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA进行克隆测序,分析其结构和功能,并用Real-timePCR检测CuZnSOD基因的表达.结果表明,CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号:GU944822),包含76 bp的5'UTR和120 bp的3'UTR序列.全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点为6.03.CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点.二级结构中α螺旋仅占1.31%.在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和褐鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%.CuZnSOD存在典型的金属结合配体结构域(GFHVHQFGDNT).基于蛋白序列所构建的分子进化树表明猪与牛的亲缘关系最近.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓,肌肉、背膘和胃中都能检测到,其在肾脏,小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

三角帆蚌热休克蛋白60基因克隆及其表达分析

利用3'RACE技术, 对高通量转录组测序所得三角帆蚌HSP60基因（hcHSP60）长片段（2629 bp）进行了3'末端克隆, 经拼接得到hcHSP60 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcHSP60 cDNA全长序列进行了特征分析, 并采用RT-PCR技术检测了其组织分布及经冷热应激后的表达变化。结果显示, hcHSP60 cDNA全长为2807 bp, 其中开放阅读框为1707 bp, 编码568个氨基酸, 预测分子量大小为61.04 ku, pH 7.0时的理论等电点为5.63。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列与光滑双脐螺HSP60同源性最高（达82%）, 而与牙鲆、白云金丝鱼HSP60的同源性最低（为75%）。RT-PCR检测结果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表达水平最高, 而在血液中的表达水平最低。30℃与35℃水温处理三角帆蚌4h后, 各组织中hcHSP60表达水平明显上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐热应激反应中起着重要作用。       

二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

根据GenBank发表的四倍体马铃薯栽培种(Solanum.tuberosum)来源的马铃薯蛋白酶抑制剂II基因序列,用PCR方法从二倍体马铃薯IVP101（Solanum.phurejia）cDNA文库和基因组DNA扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂II的cDNA和DNA,命名为PINII-2x。测序表明,PINII-2x基因组DNA全长580 bp,含有一个115 bp的内含子,cDNA有462 bp(除去终止密码子)。推测的PINII-2x分子量是16.6 kD,等电点6.08。与其他马铃薯蛋白抑制剂II同源性比较表明,核苷酸同源性高达88%;推测的氨基酸序列同源性为93%,并具有相同的活性中心。RT-PCR表明,PINII-2x的mRNA在叶片中具有强烈的伤害诱导表达特性。同时,构建了分别以水稻ActI启动子和玉米Ubi启动子驱动PINII-2x基因的双元载体。     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

Cloning and heterologous expression of nitrate reductase genes from <Emphasis Type="Italic">Dunaliella salina</Emphasis>

A cDNA corresponding to the nitrate reductase (NR) gene from Dunaliella salina was isolated by RT-PCR and (5′/3′)-RACE techniques. The full-length cDNA sequence of 3,694 bp contained an open reading frame of 2,703 bp encoding 900 amino acids, a 5′-untranslated region of 151 bp and a 3′-untranslated sequence of 840 bp with a poly (A) tail. The putative gene product exhibited 78%, 65%, 59% and 50% identity in amino acid sequence to the corresponding genes of Dunaliella tertiolecta, Volvox carteri, Chlamydomonas reinhardtii, and Chlorella vulgaris, respectively. Phylogenetic analysis showed that D. salina NR clusters together with known NR proteins of the green algae. The molecular mass of the encoded protein was predicted to be 99.5 kDa, with an isoelectric point of 8.31. This protein shares common structural features with NRs from higher plants and green algae. The full-length cDNA was heterologously expressed in Escherichia coli as a fusion protein, and accumulated to up to 21% of total bacteria protein. Recombinant NR protein was active in an enzyme assay, confirming that the cloned gene from D. salina is indeed NR.     

粘虫核糖体蛋白S7 cDNA的克隆和表达分析

运用RT-PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimna separata(Walker)核糖体蛋白S7基因(RPS7)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JN582331),并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长cDNA序列为762 bp,包括5'非编码区32 bp和3'非编码区67 bp。其开放阅读框(573 bp)编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21.924 ku,等电点为9.82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96.8%～98.2%高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础.