含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

应用重组质粒pAM—HBsAg在果蝇细胞中表达乙型肝炎病…

应用果蝇（ＤＳ２）表达系统，构建了含有乙型肝炎病毒表面抗原、摄金蛋白启动子的共表达质粒ｐＡＭ－ＨＢｓＡｇ，转染细胞，经克隆，存活细胞株的培养上清液经硫酸铵沉淀、氯化铯密度梯度离心沉淀，获得的抗原用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）法检测抗体，免疫吸印法和电泳凝胶银染显色证实分子量为２３ ０００和２７ ０００，免疫电镜观察显示表达产物为２２ｎｍ球型颗粒，通过重金属离子的诱导可增加     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

乙型肝炎病毒e抗原的纯化及其在人血清抗体检测中的应用

目的方法利用ＺｈｏｕＪｉａｎ教授提供的重组质粒ＤＮＡｐＢＶ２２０／ｅＡｇ，转染ＤＨ５α细胞，经３０℃培养３小时，４２℃培养６小时温度诱导后，提取乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层折纯化后免疫打点分析，收集阳性蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝Ｇ２５０染色，显示为单一的蛋白带，用免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫打点（ｌｍｍｕｎｏｄｏｔ）法，确定表达产物的特异性。将纯化的ＨＧｅＡｇ用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和免疫条。方法基检测人血清中的相关抗体。结果经４９例乙型肝炎病毒ｅ抗体（ＨＢｅＡｂ）阳性病人血清检验证实了其特异性。结论免疫条方法较ＥＬＩＳＡ方法更敏感、特异。     

免疫刺激DNA及IL-2表达质粒对乙肝病毒DNA疫苗诱导抗体的影响

分别将含免疫刺激ＤＮＡ序列（ＩＳＳ）的质粒ｐＵＣ１９、ｐｃＤＮＡ３及编码ＩＬ ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ ２,与乙肝病毒ＤＮＡ疫苗共同注射于小鼠胫前肌内。定量检测免疫小鼠体内ＨＢｓＡｇ的表达及血清中抗ＨＢｓ的水平。结果显示：ｐＵＣ１９、ｐｃＤＮＡ３及ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ ２对乙肝病毒ＤＮＡ疫苗在肌肉内表达ＨＢｓＡｇ无影响或有抑制,但它们均能显著促进疫苗诱导抗体的产生（Ｐ＜００１）,抗体水平的增加与ＩＳＳ的数量呈剂量反应关系。     

通过受体介导法将核酶特异导入肝细胞以阻断HBV蛋白表达的初步研究

应用半乳糖末端糖蛋白受体（ＡＳＧＰ－Ｒ）介导的内吞作用，将外源基因导入真核细胞，与脂质体介导的转染和细胞表面转铁蛋白受体（Ｔｆ－Ｒ）介导的内吞作用相比，虽然三种方式均能有效介导外源基因的转移，但ＡＳＧＰ－Ｒ法具有肝细胞特异性，而脂质体法和Ｔｆ－Ｒ法不具此特性。将克隆于真核表达载体的针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｍＲＮＡＰｒｅＣ／Ｃ区的核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ特异性导入肝细胞并发挥作用，通过酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测细胞培养液中的乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ），评价核酶在细胞水平对ＨＢＶ抗原表达的阻断作用。结果表明当核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ与ＨＢＶ抗原表达质粒ｐＵＣ－２ＨＢＶ共转染ＨｅｐＧ２细胞时，核酶对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ表达的抑制率分别为５５．２９％和６８．７３％。     

骨骼肌注射乙型肝炎表面抗原基因在小鼠体内诱发乙肝表面抗原特异的免疫反应

将含有乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ｐＡｃｔ－ＭＳ直接注入小鼠骨骼肌中，２周后加强免疫１次。免疫后４～９周间，每周检测小鼠血清中ＨＢｓ。结果表明实验组６／８只小鼠ＨＢｓ为阳性，对照组８只小鼠均未检测到ＨＢｓ。本实验证实直接注射质粒ＤＮＡ外源基因能获得表达，并能引起免疫反应。     

骨骼肌注射乙型肝炎表面抗原基因在小鼠体内诱发乙肝表面抗…

将含有乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ｐＡｃｔ－ＭＳ直接注入小鼠骨骼肌中，２周后加强免疫１次。免疫后４￣９周间，每周检测小鼠血清中ＨＢｓ。结果表明实验组６／８只小鼠ＨＢｓ为阳性，对照组８只小鼠均未检测到ＨＢｓ。本实验证实直接注射质粒ＤＮＡ外源基因能获得表达，并能引起免疫反应。     

丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨

目的：探索ＨＣＶ－ＤＮＡ核酸免疫效应。方法：将构建的重组体ｐＣＤ－ＨＣＶｓ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用ＥＬＩＳＡ和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测了免疫鼠血清抗体、脾细胞和ＰＢＭＣ对ＨＣＶ抗原的增殖反应。结果：重组体ｐＣＤ－ＨＣＶ１、ｐＣＤ－ＨＣＶ２和ｐＣＤ－ＨＣＶ３均可诱导小鼠（ｎ＝６）产生抗体（０．６６５￣０．７０７,ＯＤ值）和脾细胞对ＨＣＶ抗原增殖反应（ｎ＝６,ＳＩ为３．８９￣４．４７）,但各重组体间的     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响

目的 在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法 构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果 成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示:不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明:高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论 在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.     

HBsAg基因疫苗诱导小鼠抗体产生的观察

将携带编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主要蛋白的S基因的质粒,直接注射小鼠肌肉中,小鼠4周后产生抗-HBs,阳转率83.3%(5/6),加强组阳转率66.7%(2/3),未加强组阳转率为100%(3/3);两组小鼠抗体持续时间可达28周以上;4周以后小鼠体内未检测到HBsAg.     

用微弹轰击法介导的转基因对小鼠进行乙肝病毒遗传免疫研究

用包裹ＤＮＡ的金微弹轰击耳朵，将表达乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒转入小鼠皮肤细胞，在小鼠血清中检测ＨＢｓＡｇ及抗－ＨＢｓ抗体。实验组８只小鼠中，有３只在基因转移３天后检测到ＨＢｓＡｇ。１４天再轰击１次。１６天后２只鼠中检测到抗－ＨＢｓ抗体。２８天后４只鼠中检测出抗ＨＢｓ抗体。对照组４只小鼠中ＨＢｓＡｇ及抗－ＨＢｓ抗体均未检测出。本实验为今后进一步分析乙肝病毒的遗传免疫奠定了实验基础，提供了实验依据。     

两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其免疫原性比较

目的:利用毕赤酵母表达系统表达两种融合形式的乙肝病毒表面抗原(HBsAg-s和s-HBsAg),并对融合蛋白的免疫原性进行研究。方法:用毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9k为载体,通过PCR方法引入(Gly4Ser)3连接肽的编码基因将GM-CSF融合到HBsAg基因的3′端或5′端进行分泌表达,表达产物以SDS-PAGE及Western blot进行分析并通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行蛋白纯化。将纯化的两种融合蛋白与单纯的HBsAg蛋白分别免疫小鼠,ELISA方法检测HBsAg特异的抗体反应水平。结果:两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白均可在毕赤酵母菌株GS115中获得了分泌表达,Western blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合。免疫后的血清ELISA结果显示,相比单纯的HBsAg蛋白,两种融合蛋白可以诱导出更高的抗体水平(P<0.05),其中将GM-CSF蛋白融合在HBsAg蛋白的C端效果要好于融合在N端。结论:通过与GM-CSF蛋白的融合可以显著增强HBsAg的免疫原性,这为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。     

HBV-S基因逆转录病毒重组载体的构建及其在抗原提呈细胞中的表达

目的: 为探索逆转录病毒载体在免疫细胞中的表达和基因治疗中的应用。方法:用DNA重组技术构建乙肝病毒表面抗原C(HBV-S)基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染PA317后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染 HepG₂、巨噬细胞 (RAW264.7)和EL₄细胞,分别用RT-PCR及ELISA法检测目的基因表达。结果:HBsAg在上述细胞中获得不同程度的表达,48 h细胞上清中HBsAg含量(A值)分别为0.92、0.53、0.42。结论:本实验所用载体,其目的基因可 在细胞内稳定表达,而且,在巨噬细胞等抗原提呈细胞中均有较高的表达,这提示我们质粒免疫有可能通过刺激巨噬细胞诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。作为一种高效的基因转移系统,该表达系统可用于基因免疫和基因治疗。     

利用穿梭质粒快速构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg …

目的 应用新型杆状病毒表达系统快速构建含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒，高效表达ＨＢｓＡｇ，为ＨＢＶ诊断试剂、疫苗及治疗研究提供依据。方法 构建含有ＨＢｓＡｇ基因的供体质粒ｐＦＢ－ＢＳ，转化Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达试剂盒中的ＤＨ１０Ｂａｃ致敏菌，利用其含有的细菌Ｔｎ７转座繁忙将ＨＢｓＡｇ基因重组至穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ上，快速筛选出含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒。结果 此重组病毒能在昆虫细     

含日本脑炎病毒pre-M/E蛋白基因真核表达质粒的构建及免疫效果观察

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时表达。大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击后特异性抗体的产生。     

Mechanism and therapeutic potential of DNA-based immunization against the envelope proteins of hepatitis B virus in normal and transgenic mice

Two plasmid DNA vectors, pCAGGS(S) encoding the genes of the major envelope protein of hepatitis B virus (HBV), and pCAGGS(S + preS2) encoding the genes of the middle envelope protein were used to study the mechanism and therapeutic potential of DNA-based immunization. Injection of these plasmids into the regenerating bilateral tibialis anterior muscle (TA) of normal C57BL/6 mice induced hepatitis B surface antigen (HBsAg)-specific humoral and cellular immune responses. Seventy-two hours after injection of pCAGGS(S), infiltrating cells including antigen-presenting dendritic cells (DC) were localized around the injection site and HBsAg was expressed by both muscle cells and infiltrating cells. Spleen DC from the mice were exposed to HBsAg for up to 32 weeks after a single injection of pCAGGS(S), because these DC induced the proliferation of HBsAg-specific memory lymphocytes in culture without exogenous HBsAg. A single injection of pCAGGS(S) or pCAGGS(S + preS2) resulted in the clearance of HBsAg in 28 out of 30 HBV-transgenic (Tg) mice. In contrast, more than 7 monthly injections of an HBsAg-based vaccine were required for the clearance of HBsAg in 6 out of 29 HBV-Tg mice. Infiltrating DC at the DNA vaccine injection site may have a role in initiating HBsAg-specific immune response, whereas the persistence of HBsAg exposed spleen DC may contribute to long-lasting immunity. This study also suggested that DNA-based vaccines may be a potent tool for treating chronic HBV carriers.