人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高灵敏度和高特异性的人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行初步评估.方法 构建含有H5N1亚型禽流感病毒NS1序列的pET-28a(+)重组载体的大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达NS1蛋白,并经Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得NS1重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗NS1血清,亲和纯化获得多克隆抗体.应用ELISA和Western Blot检测纯化抗体的效价和特异性.结果 NS1融合蛋白得到高表达,且纯度＞90％,用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后得到的抗NS1多克隆抗体,效价达1∶80 000,并特异性识别H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白.结论 获得了NS1多克隆抗体,具有较好的效价和特异性.     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

结核分枝杆菌休眠生存调节子蛋白Rv2628的表达、纯化及其兔多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化结核分枝杆菌休眠生存调节子蛋白Rv2628,制备并鉴定其兔多克隆抗体。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，扩增Rv2628基因，构建重组表达质粒，转化至大肠杆菌表达菌株中，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达，利用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)层析柱纯化目的蛋白，以纯化Rv2628蛋白免疫新西兰大白兔获得兔多克隆抗体，分别利用Western blot法和间接ELISA验证多克隆抗体的特异性。结果 成功构建pET-30a-Rv2628重组载体，IPTG诱导后Rv2628蛋白在大肠杆菌主要以包涵体形式表达，Ni-NTA层析柱纯化获得高纯度Rv2628蛋白。免疫兔后获得兔抗Rv2628多克隆抗体具有良好的抗原结合特性，且抗体效价达1∶1 093 500。结论 成功制备高纯度Rv2628蛋白及高效价兔抗Rv2628多克隆抗体。     

H37Rv结核分枝杆菌蛋白脯氨酸-谷氨酸8(PE8)的表达及其兔多克隆抗体制备

目的克隆Rv1040c结核分枝杆菌脯氨酸-谷氨酸8(PE8)基因、构建pET28a-PE8重组载体和表达纯化PE8蛋白,制备抗PE8多克隆抗体。方法利用重组克隆技术,将PE8基因克隆至原核表达载体pET28a,测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、稀释复性与纯化。用纯化PE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot法进行效价及特异性鉴定。结果成功构建pET28a-PE8原核表达载体, ITPG诱导后PE8蛋白在大肠杆菌主要以包涵体的形式表达,复性后纯化PE8蛋白纯度达90%,纯化多克隆抗体效价为1∶430 080以上,能与PE8蛋白发生特异性反应。结论大肠杆菌表达的PE8重组蛋白免疫新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体。     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

重组人促甲状腺激素β亚基的切胶纯化及多克隆抗体制备

目的:切胶纯化重组人促甲状腺激素亚基(hTSHβ),免疫家兔制备多克隆抗体,为人TSH测定试剂盒的国产化奠定基础。方法:将含有重组人促甲状腺激素β亚基(hTSHβ)的大肠杆菌表达产物进行SDS-PAGE分离,切取相应分子量的蛋白条带,研磨回收后用于免疫新西兰大耳朵白兔,ELISA监测血清中抗hTSHβ抗体的效价,饱和硫酸铵沉淀及亲和层析自血清中纯化抗体。结果:切胶后获得了高纯度的重组GST-hTSHβ蛋白,所免疫家兔产生了针对hTSHβ的多克隆抗体,效价可达1:12000。结论:切胶纯化的重组hTSHβ蛋白可成功诱导兔产生高效价的抗hTSHβ多克隆抗体。     

含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体。方法以重组质粒p GEX-6p-1-ADAMTS2(1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性。结果在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清。血清效价达到1∶160 000以上,且具有良好的特异性。结论成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。     

人精子肌动蛋白样蛋白7a蛋白在大肠杆菌系统的表达纯化及多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌系统表达并纯化人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)的N段(1-70),制备兔抗ACTL7a多克隆抗体.方法 构建重组表达质粒pGEX-6p-1-ACTL7a(1-70),以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌,IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂和谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B树脂两次亲和纯化和分子筛分离目的蛋白;以表达的ACTL7a(1-70)蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ACTL7a的多克隆抗体.ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光组织化学技术检测ACTL7a在曲精小管细胞的表达.结果 经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a(1-70),纯化后免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清.血清效价达到1∶160000以上,且具有良好的特异性.结论 成功构建了ACTL7a基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,经纯化获得高纯度的目的蛋白;制备出兔抗ACTL7a抗体,效价及特异性均良好.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

鸡肺表面活性蛋白A的表达及其多克隆抗体的制备

目的表达鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)重组蛋白,并制备鼠抗cSP-A多克隆抗体。方法人工合成cSP-A的凝集素糖识别区(CRD)基因(cSP-A-CRD),亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。切胶纯化法纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。结果获得鼠抗cSP-A血清,效价达到105;Western blot法结果表明多抗血清具有良好的特异性和反应性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞表达的cSP-A和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。结论成功表达了cSP-A重组蛋白并制备了小鼠抗cSP-A多克隆抗体。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的表达、鉴定及抗血清的制备

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,鉴定并纯化重组rPPE68蛋白后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PPE68多克隆抗体。方法将已经过鉴定的重组原核表达质粒pET32a(+)-PPE68转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导大量表达PPE68蛋白。对表达蛋白进行鉴定后利用亲和层析法进行纯化。以纯化后重组rPPE68为免疫抗原,与弗氏不完全佐剂等体积混合,采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,于第3次免疫后的第7天采血。用凝集实验与Western-blot检测抗血清的特异性,并用双向免疫扩散法测定抗血清效价。结果在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量57 000处可见特异性条带,免疫印迹分析证实表达的目的蛋白可与结核分枝杆菌H37Rv株感染小鼠的血清发生反应。纯化的rPPE68蛋白免疫新西兰大白兔后,凝集反应与Western-blot证实了抗血清的特异性,双向免疫扩散法测得血清效价为1∶16。结论已成功表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,制备了特异性兔抗PPE68多克隆抗体,对结核病的早期诊断提供了一种新的思路。     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD, 并制备兔抗β6LBD多克隆抗体.方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段, 经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体, 构建的 pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒, 转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株, 经IPTG诱导表达, SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体, 纯化目的蛋白.然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体, 以ELISA方法测定抗体效价, 并以Western blot鉴定其特异性.结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42 000的GST-β6LBD融合蛋白, 与预期结果相符.目的蛋白纯化后, 在电泳图片上显示较为清晰的单一条带, 用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上, 具有较高的特异性.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体, 为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础.     

肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的制备本课题组报告的肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法以本课题组前期构建的人MBP-Kinectin融合片段重组质粒为基础,原核表达和亲和层析大量纯化MBP-Kinectin融合蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,用Western blot鉴定抗体的特异性。同时用Kinectin多克隆抗体检测Kinectin在正常成人肝细胞HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721内的表达。结果通过免疫新西兰兔获得抗Kinectin抗体,ELISA测定纯化的Kinectin抗体效价最高为1∶12 800,Western blot结果显示Kinectin抗体具有较好的特异性。免疫细胞化学和western blot检测发现Kinectin蛋白在肝癌细胞株内的表达显著高于正常成人肝细胞株。结论制备的抗Kinectin抗体具有较高的效价和特异性,能满足Western blot和免疫细胞化学检测Kinectin蛋白的要求,为进一步深入研究Kinectin在肝癌发生发展中的作用奠定基础。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

兔抗重组人钙网蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗人钙网蛋白抗体并进行特性鉴定。方法:用PCR法扩增人钙网蛋白(CRT)基因,并克隆至pET32a表达载体中。以重组质粒pET32a/hCRT转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化目的蛋白。以纯化的hCRT为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗体,用ELISA法、Westernblot和免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果:成功地表达并纯化hCRT重组蛋白。以纯化的重组hCRT免疫新西兰大白兔制备的抗体,ELISA检测其效价为1∶51 200,Western blot分析显示,该抗体能与hCRT特异性结合。免疫组化染色法检测结果表明,该抗体能识别天然的hCRT。结论:以重组hCRT为免疫原,成功地制备效价高、特异性好的兔抗hCRT抗体,为进一步进行钙网蛋白的检测及其临床应用研究奠定了基础。     

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.