钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达

目的 构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因的重组原核表达质粒,为进一步制备以LipL41为目的基因的亚单位免疫苗提供实验依据。方法 根据钩端螺旋体L.kirscneri RM52株外膜脂蛋白LipL41基因序列设计引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行PCR扩增并DNA测序,以质粒pGEX1λT为载体,插入LipL41基因片段构建重组原核表达质粒,并检测LipL41的表达。结果 测序结果示所得片段为LipL41的编码序列,酶切及PCR分析证实重组质质构建成功,SDS－PAGE和Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质LipL41。结论 LipL41基因的重组原核表达质粒构建成功,并可在大肠杆菌中高效表达。     

钩端螺旋体Lipl21基因真核质粒构建及在HeLa细胞的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据. 方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21转染入HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达. 结果双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变.重组质粒pcDNA3.1（＋）/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21. 结论成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/Lipl21,且能够在体外真核细胞中表达,为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础.     

钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21的构建与鉴定

目的构建钧端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达载体，寻找新的预防钧端螺旋体感染的候选疫苗。方法应用PCR技术从钧端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增LipL21基因，纯化回收后克隆入pUCm-T载体，再亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了LipL21真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的LipL21基因序列完全一致。结论成功构建了钧端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21。     

钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达

目的　构建钩端螺旋体外膜脂蛋白 L ip L41基因的重组原核表达质粒 ,为进一步制备以 L ip L41为目的基因的亚单位疫苗提供实验依据。方法　根据钩端螺旋体 L.kirscneri RM5 2株外膜脂蛋白 L ip L41基因序列设计引物 ,以赖型钩端螺旋体 0 17株基因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增并 DNA测序 ,以质粒 p GEX1λT为载体 ,插入 L ip L41基因片段构建重组原核表达质粒 ,并检测 L ip L41的表达。结果　测序结果示所得片段为 L ip L41的编码序列 ,酶切及 PCR分析证实重组质粒构建成功 ,SDS- PAGE和 Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质 L ip L41。结论　 L ip L41基因的重组原核表达质粒构建成功 ,并可在大肠杆菌中高效表达     

问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位

目的:改建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL21基因核苷酸序列以提高表达产量并了解基因改建前后表达产物免疫原性变化,确定外膜脂蛋白LipL21在钩体表面的定位。方法:参照大肠杆菌偏爱密码子设计,合成lipL21基因核苷酸序列并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测改建前后lipL21基因表达量变化。采用钩体TR/Patoc抗血清为一抗的Western blot鉴定改建前后两种目的重组蛋白rLipL21s的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)比较改建前后rLipL21s抗血清对不同钩体血清群的交叉免疫凝集效价变化。应用免疫电镜技术对LipL21进行定位。结果:改建前后lipL21基因表达量分别为细菌总蛋白的8.5%和46.5%。两种rLipL21均能与TR/Patoc抗血清发生免疫结合反应,免疫家兔后均能产生特异性抗体。两种rLipL21兔抗血清对我国15群15型钩体参考标准株MAT效价相近,均为1∶80~1∶320。LipL21位于钩体外膜表面。结论:LipL21是钩体表面抗原。改建后的lipL21基因可明显提高原核表达产量,其产物可保持良好的抗原性和免疫反应性,其抗体具有广泛的交叉免疫凝集活性。     

波摩那型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因片段的克隆表达

目的　构建L3 2_pGEX_5x_2重组质粒 ,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL3 2。方法　PCR获取编码LipL3 2的基因片段 ,构建重组克隆载体和表达载体 ,转化受体菌 ,诱导表达重组LipL3 2蛋白。将重组LipL3 2蛋白和钩体抗血清进行Western_blot。结果　扩增出约 750bp的LipL3 2成熟蛋白基因 ,LipL3 2基因插入pGEX_5x_2表达载体 ,表达产物谷胱甘肽S_转移酶 (GST ,2 6× 10 3)与LipL3 2蛋白的融合蛋白的相对分子质量约为 53× 10 3 ,与预期大小一致。Western_blot显示重组LipL3 2蛋白能与钩体抗血清特异结合。结论　LipL3 2蛋白能在大肠埃希菌中表达 ,重组LipL3 2蛋白具有免疫反应性     

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定.方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量.采用免疫双扩散试验及Western Blot,鉴定rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2的免疫原性.结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coli BL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2.表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78 mg/L,是优化前的3.7倍.rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2.rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号.结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原.     

赖型钩端螺旋体601株OmpL1蛋白的表达、纯化及功能分析

目的对钩端螺旋体黄疸出血群赖株ompL1基因进行克隆、表达及产物的纯化。方法从我国钩端螺旋体黄疸出血群赖株基因组中扩增全长ompL1基因片段,克隆至pGEM-T载体,回收经EcoRⅠ HindⅢ双酶切产物,将其与表达载体pET32a连接,通过酶切图谱和序列分析法筛选出重组质粒。将含重组质粒的宿主菌诱导表达后,提取全菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果获得pET9L重组质粒,经诱导表达后得到分子量为31000的重组蛋白。测序得到的ompL1基因核苷酸序列与已发表ompL1基因序列(GenbankI61405)同源性为99.8%,所推导的氨基酸序列(GenbankLA3138)的同源性达100%。结论成功构建了ompL1基因的原核表达系统,为进一步制备以OmpL1为检测靶抗原的免疫层析试剂盒奠定基础。     

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究

目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。     

Molecular cloning and expression in E. coli of the surface-exposed lipoprotein LipL41 gene of Leptospira lai]

OBJECTIVE: To construct a recombinant expressive plasmid using LipL41 gene of leptospira lai for further research of subunit vaccine of leptospira. METHODS: A pair of oligonucleotide primers were designed based on the sequence of LipL41 of leptospira kirschneri RM 52 in Genbank. With genomic DNA of leptospira lai 017 as template, a fragment was amplified by PCR and DNA sequencing analysis showed this fragment to be the gene that encodes LipL41. A recombinant vector was constructed using plasmid pGEX1 lambda T and the expression of LipL41 gene was tested. RESULTS: The production of PCR was LipL41 gene. The recombinant plasmid was constructed and testified by nuclease digestion and PCR, and LipL41 gene could express in E. coli. CONCLUSION: The recombinant plasmid has been constructed successfully and LipL41 gene can express stably at high level.     

胃癌相关基因GCRG213的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213。方法：采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列，将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达重组融合蛋白，SDS-PAGE分析表达产物。结果：高效表达出相对分子量约29.4ku的重组融合蛋白。薄层凝胶扫描显示，其表达量占菌体总蛋白质的28.7％。结论：在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin-GCRG213融合蛋白，为后续功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白，并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法 从肝癌细胞系HepG2提取总RNA，用RT-PCR扩增出PPARγC1 cDNA的编码序列，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，重组载体在酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白，SDS-PAGE分析表达产物，通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白，并以此为抗原制备多克隆抗体。Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果 经测序、酶切鉴定证明，PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体，为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。     

GCRG224在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224,制备高纯度的GCRG224蛋白。方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果:SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约16.8ku的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%。经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品。结论:在大肠杆菌中成功表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并制备了高纯度的蛋白产品,为后续功能研究及其抗体研制创造了条件。     

HIV-1 Tat基因在pEGx-KG中的融合构建及原核表达

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达融合的Tat蛋白。方法:用PCR方法从HIV cDNA文库中扩增出Tat基因,并将其插入到表达载体pEGx-KG中,转化到E.coli中进行融合表达,表达产物用蛋白电泳和Western-blot进行鉴定。结果:成功地构建了重组质粒pEGx-KG-Tat,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达。蛋白电泳和Western-blot分析表明,在相对分子质量(Mr)为38.9kDa处有1条特异性的带。结论:GST基因与HIV-1 Tat基因的融合构建,使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为艾滋病的防治研究奠定了基础。     

A型流感病毒株A/Henan/703/2001(H3N2)核蛋白部分序列的原核表达

目的构建A型流感病毒核蛋白（NP）基因部分序列的原核表达质粒。并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法采用PCB方法扩增NP基因部分序列，并定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中。转化大肠杆菌BL21．将阳性菌落经IPTG诱导目的基因融合蛋白的表达。结果扩增到NP基因部分序列，构建成重组表达质粒pGEX—S NP,并在大肠杆菌中进行了表达。结论成功构建A型流感病毒NP部分基因序列的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达了目的基因融合蛋白。     

人神经营养素-4基因的克隆及表达

目的 通过基因工程的方法扩增人神经营养素-4(hNT-4)cDNA,在大肠杆菌中表达hNT-4,为研究hNT-4的生物学作用提供材料.方法 以人胎脑RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hNT-4 cDNA,将其插入的质粒pGEM-T中.将经过序列分析确定的hNT-4 cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达载体pGEX-6p-1-NT-4,用SDS-PAGE法测定融合蛋白在大肠杆菌中的表达.结果 经序列测定分析,克隆的hNT-4 cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank,M86528)完全一致,并获得了高效表达hNT-4的重组菌株.结论 体外成功扩增hNT-4 cDNA,并在原核细胞中高效表达了hNT-4.