同期放化疗诱导人结直肠癌细胞发生上皮-间质转化

目的:探讨放化疗抵抗的结直肠癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的意义.方法:采用5-FU化疗同期进行放疗对人结直肠癌野生型细胞(HCTll6)进行干预,诱导放化疗共同抵抗的细胞株(HCT1 16CRR)并采用克隆形成实验进行放化疗抵抗性的鉴定.高倍显微镜下观察细胞形态学变化.采用Real-time PCR和Western印迹,检测上皮表型标志物E-cadherin,间质表型标志物N-cadherin、波形蛋白(vimentin)、核转录因子(Snail)mRNA及其蛋白的表达.结果:放化疗抵抗的结直肠癌细胞发生与EMT相符的形态学改变,细胞呈纺锤体状,极性消失,并出现伪足;Real-time PCR和Western印迹结果显示E-cadherin mRNA及蛋白表达下调;N-cadherin,vimentin,Snail mRNA及蛋白表达上调,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:放化疗抵抗后的人结直肠癌细胞发生EMT,其与结直肠癌的治疗抵抗相关.     

SphK1和FAK对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化的影响

 目的: 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase l,SphK1)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法: 将人结肠癌HCT116细胞分成3组:采用SphK1抑制剂N,N-二甲基鞘胺醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS)、FAK抑制剂PF573228和相同体积的培养基分别处理细胞。MTT法检测细胞活力,Western blot方法检测SphK1、FAK、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达,real-time PCR检测SphK1、鞘氨醇1-磷酸(S1P)、FAK、E-cadherin和vimentin mRNA的表达,并应用细胞划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力。结果: PF573228和DMS均明显抑制人结肠癌HCT116细胞的活力,并呈时间剂量依赖性。DMS抑制SphK1的表达,同时下调FAK、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表达,而上调E-cadherin蛋白表达上调。PF573228明显抑制FAK的表达,同时抑制SphK1、N-cadherin、vimentin和MMP2的表达,上调E-cadherin蛋白的表达(P<0.01)。划痕实验显示PF573228和DMS显著抑制HCT116细胞的迁移能力(P<0.01)。与对照组比较,PF573228组和DMS组FAK、SphK1、S1P以及vimentin mRNA的表达明显下调,而E-cadherin mRNA的表达则明显上调(P<0.05)。结论: SphK1和FAK信号通路可能在结肠癌HTC116细胞上皮间质转化过程中发挥重要作用。     

二苯乙烯苷通过PI3K/AKT通路抑制TGFβ诱导的结直肠癌上皮间质转换

目的:探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-Ο-β-D-glucoside,THSG)对TGFβ诱导的结直肠癌细胞上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及可能的分子机制.方法:通过转化生长因子(transforming growth factorβ,TGFβ)诱导HCT116细胞发生EMT,倒置显微镜观察细胞形态变化,Western印迹检测EMT相关分子标志物的表达;划痕实验、细胞迁移实验、倒置显微镜观察不同浓度THSG干预TGFβ刺激对HCT116细胞运动、迁移能力以及形态学的影响,Western印迹检测EMT相关标志物及PI3K/AKT通路的改变.结果:TGFβ刺激HCT116细胞后,细胞由圆形变为长梭形,E-cadherin表达降低,vimentin和N-cadherin表达增加;与对照组相比,THSG可增加E-cadherin和PTEN的表达,降低vimentin和N-cadherin和p-AKT表达,同时抑制细胞的迁移及运动(F=454.723,P<0.001;F=412.161,P<0.001).结论:THSG可通过PI3K/AKT通路抑制TGFβ诱导的HCT116细胞EMT,并降低其运动迁移能力.     

SCUBE2过表达通过Wnt/β-catenin抑制结直肠癌细胞上皮-间质转化

目的:研究信号肽-CUB-EGF结构域蛋白2(SCUBE2)对结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的分子机制。方法:首先,用real-time PCR与Western blot法检测人结直肠癌HCT116细胞和正常人结直肠上皮FHC细胞SCUBE2的表达;HCT116细胞转染GV144-SCUBE2质粒过表达SCUBE2后,MTT、Transwell和流式细胞术分别检测其对细胞活力、迁移和凋亡的影响。转染GV144-SCUBE2质粒6 h后加入10μg/L重组转化生长因子(TGF)-β1蛋白继续培养48 h,real-time PCR或者Western blot法检测EMT标志物[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snail]、β-catenin、c-Myc和细胞周期蛋白(cyclin)D1的表达。随后,在HCT116细胞中使用Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)或抑制剂XAV93920并加入TGF-β1且过表达SCUBE2,检测Wnt/β-catenin通路激活或阻断后对HCT116细胞EMT的影响。结果:HCT116细胞中SCUBE2的表达明显低于FHC细胞;过表达SCUBE2能够抑制HCT116细胞的活力与迁移,但是对其凋亡影响不大;SCUBE2增加了E-cadherin的表达,降低了TGF-β1诱导的vimentin、Snail、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达,XAV93920增强了SCUBE2对EMT的影响,而Li Cl阻碍SCUBE2对EMT的影响。结论:过表达SCUBE2能够抑制结直肠癌细胞的生长与迁移,抑制其EMT的发生,这一过程可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的。     

CARMA3基因敲减对结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移的抑制

目的:探讨CARMA3基因在人结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移中的作用及其机制。方法:选取高表达CARMA3的人结肠癌细胞株。应用慢病毒技术敲减CARMA3基因,puromycin筛选后构建稳定转染的HCT116-sh CARMA3细胞株。Real-time PCR和Western blot鉴定mRNA和蛋白表达的抑制情况。WST-1法和RTCA S16系统分析细胞增殖情况。集落形成实验观察集落形成。流式细胞术检测细胞周期。显微镜下观察上皮-间充质转化(EMT)形态变化。划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力的改变。Western blot分析相关分子变化,探讨可能机制。结果:4株人结肠癌细胞株中HCT116细胞的CARMA3 mRNA和蛋白表达量最高,构建稳定沉默CARMA3的HCT116-sh CARMA3细胞株,其中HCT116-sh CARMA3-93细胞中CARMA3的mRNA和蛋白受抑制最明显,将其作为细胞模型。相比于对照组,HCT116-sh CARMA3-93细胞形态发生EMT逆转,其增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显下降(P0.01)。HCT116-sh CARMA3-93的G_0/G_1细胞所占比例明显升高,S期细胞比例相应下降(P0.05)。信号通路分子Bcl10和NF-κB表达明显下调,MALT-1变化不明显;细胞周期相关蛋白cyclin D1显著下调,cyclin A表达略有下降;侵袭转移相关分子MMP-2和MMP-9的表达下调,MMP-7未见改变,TIMP-1和TIMP-2的表达上调;EMT相关分子E-cadherin的表达水平升高,N-cadherin、Snail、Slug和Twist的表达水平呈不同程度降低。结论:CARMA3可通过改变细胞周期和侵袭转移分子的表达、调控EMT来影响结肠癌细胞HCT116的生长和侵袭转移。这可能与NF-κB信号通路发生改变有关。     

子宫颈鳞状细胞癌中GDF-15与EMT相关蛋白的表达及相关性

目的检测子宫颈鳞状细胞癌组织中GDF-15及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达,探讨GDF-15在子宫颈鳞状细胞癌发生、侵袭中的生物学作用。方法采用免疫组化EliVision两步法检测85例子宫颈鳞状细胞癌组织及其配对癌旁子宫颈组织中GDF-15、E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达,分析GDF-15表达与子宫颈鳞状细胞癌临床病理特征的关系及GDF-15与EMT相关蛋白表达的相关性。结果与癌旁子宫颈组织相比,子宫颈鳞状细胞癌组织中GDF-15、N-cadherin和vimentin表达上调,E-cadherin表达下调,差异有统计学意义(P均0.05)。子宫颈鳞状细胞癌组织中GDF-15表达与N-cadherin和vimentin表达呈正相关(r_s=0.422,r_s=0.374),与E-cadherin表达呈负相关(r_s=-0.305)。结论 GDF-15与EMT相关蛋白在子宫颈鳞状细胞癌组织中异常表达,过表达GDF-15在子宫颈癌的发生、侵袭中发挥重要作用,可能与诱导子宫颈癌EMT有关。     

重楼皂苷Ⅶ抑制结肠癌细胞迁移、侵袭及机制研究

目的研究重楼皂苷Ⅶ对人结肠癌HCT116细胞和SW620细胞迁移、侵袭的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法用MTT方法测定重楼皂苷Ⅶ对HCT116细胞和SW620细胞的半数抑制浓度;划痕实验和Transwell迁移实验观察重楼皂苷Ⅶ抑制HCT116细胞和SW620细胞的迁移能力;侵袭实验观察重楼皂苷Ⅶ抑制HCT116细胞和SW620细胞的侵袭能力。Western blot检测蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达。结果重楼皂苷Ⅶ抑制HCT116细胞和SW620细胞增殖,其IC50值分别为(3.72±0.09)μmol/L和(3.46±0.13)μmol/L;重楼皂苷Ⅶ对人结肠癌HCT116细胞和SW620细胞迁移、侵袭有一定的抑制作用,其作用呈明显的剂量依赖性;Western blot检测发现,给予重楼皂苷Ⅶ处理细胞后,明显升高E-cadherin蛋白表达水平,降低N-cadherin蛋白表达水平,均具有统计学意义(P<0.05)。结论重楼皂苷Ⅶ对人结肠癌HCT116细胞和SW620细胞增殖、迁移、侵袭有一定的抑制作用,其作用呈明显剂量依赖性,并影响上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达,其机制可能是调控EMT过程抑制细胞迁移和侵袭。     

紫草素对HGF诱导的人肺癌细胞上皮-间充质转化的逆转作用

目的:探讨紫草素(shikonin)对肝细胞生长因子(HGF)诱导的人非小细胞肺癌PC9细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:用HGF诱导PC9细胞建立EMT模型,采用不同剂量的shikonin干预24 h后,MTT法检测细胞活力;划痕愈合实验检测细胞的迁移能力;Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力;Western blot法检测细胞中上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白表达水平。结果:Shikonin可显著抑制PC9细胞的活力(P0.01),随着给药剂量的增加,shikonin对细胞的生长抑制率显著上升,并呈一定的剂量依赖关系,IC_(50)为9.364μmol/L。HGF可诱导PC9细胞发生迁移和侵袭;划痕愈合实验和Transwell小室实验显示,shikonin能明显抑制由HGF诱导的肺癌PC9细胞迁移和侵袭(P0.01)。Western blot检测结果显示HGF可诱导PC9细胞的EMT标志物E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin和vimentin蛋白表达上调,使其发生EMT;shikonin则可逆转由HGF诱导的PC9细胞E-cadherin蛋白表达下调及N-cadherin和vimentin蛋白表达上调(P0.01)。结论:Shikonin能逆转由HGF诱导的肺癌PC9细胞EMT,同时抑制其迁移和侵袭。     

长链非编码RNA EVADR促进人结直肠癌细胞系增殖及迁移

目的探讨lncRNA EVADR对人结直肠癌HCT116和LOVO细胞系的增殖和迁移的影响以及其作用机制。方法利用慢病毒感染方式分别构建稳定过表达lncRNA EVADR的HCT116和LOVO细胞系;用CCK-8检测细胞的增殖;Transwell小室法检测细胞迁移能力,Western blot检测E-cadherin的表达,实时荧光定量PCR检测Snail、Slug、ZEB1和ZEB2 mRNA的表达。结果成功构建了稳定过表达lncRNA EVADR的结直肠癌HCT116和LOVO细胞系。与HCT116-NC和LOVO-NC细胞组对比,HCT116-EVADR与LOVO-EVADR细胞组的增殖和迁移能力明显提高(P<0.05)。同时,上皮标志物E-cadherin表达明显降低,而Snail、Slug、ZEB1和ZEB2间质化标志物的表达升高。结论过表达lncRNA EVADR具有促进结直肠癌HCT116和LOVO细胞的增殖与迁移能力,可能通过调节结直肠癌细胞上皮间质转化(EMT)发挥作用。     

Gli2基因沉默逆转肝癌细胞系SMMC-7721的上皮间质转化

目的探讨胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Gli2)对肝癌细胞系SMMC-7721上皮间质转化(EMT)和侵袭能力的影响及机制。方法合成shRNA-Gli2、shRNA-NC病毒载体,实验设shRNA-Gli2组、shRNA-NC组和空白组,转染SMMC-7721细胞。用Transwell小室和细胞黏附实验观察细胞侵袭及黏附能力;用qRT-PCR和Western blot检测细胞间Gli2、E-cadherin、N-cadherin及vimentin基因和蛋白的表达。结果在不同肝癌细胞系中,随着肝癌细胞系侵袭能力的增强,Gli2的表达逐渐增高,shRNA-Gli2组与对照组相比侵袭能力降低,同种黏附能力增加,异种黏附能力降低(P0.05)。shRNA-Gli2组与对照组相比,E-cadherin表达明显增高而N-cadherin和vimentin表达明显降低(P0.05)。结论沉默Gli2的表达能够促进肝癌细胞SMMC-7721 EMT的反转,并降低其侵袭能力,机制可能与E-cadherin的上调和N-cadherin、vimentin的下调有关。     

上皮钙黏蛋白、波形蛋白和Snail蛋白表型在乳腺浸润性导管癌中表达的相关性及其与预后的关系

目的 检测上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和Snail蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达情况与乳腺癌病理特征的关系及其与浸润性导管癌预后的关系.方法 采用Envision免疫组织化学方法对89例乳腺浸润性导管癌组织中的上E-cadhenn,Vimentin和Snail蛋白表达情况进行检测并分析表达程度与临床病理特征之间的关系;统计分析采用卡方检验、Fisher精确概率法检验Spearman等级相关检验、配对计数资料检验、Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,Cox比例风险模型进行生存的多因素分析.结果 E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白在浸润性导管癌组织中的阳性表达率分别为、47.1％、53.9％和55.0％,三者呈负相关,(P=0.003);E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达与临床TNM分期有关(P ＜0.005).浸润性导管癌中Snail蛋白、Vimentin表达明显增高,Snail蛋白与淋巴结转移有关(P =0.029);Vimentin与淋巴结转移、雌激素状态有关(P =0.006,P＜0.001);E-cadherin表达明显降低,与孕激素状态有关(P =0.030);分子分型结果显示,管腔A型、HER-2阳性型组的Vimentin、Snail蛋白阳性表达率低于基地细胞样型组(P =0.012),而E-cadherin表达率则高于基地细胞样型组(P =0.004).Cox分析发现,E-cadherin低表达和Vimentin的过度表达与患者总生存期(P =0.019、P=0.045)及患者无病生存期(P =0.032、P=0.024)显著相关,但Snail蛋白的表达与总生存期及无病生存期无相关性(P =0.879、P=0.835).结论 E-cadhern、Vimentin和Snail蛋白在乳腺浸润性导管癌的发生、发展、侵袭及转移中起重要作用,对认识乳腺癌的生物学特性以及对指导乳腺癌的诊疗及预后具有重要意义.     

Silencing of CEMIP suppresses Wnt/β-catenin/Snail signaling transduction and inhibits EMT program of colorectal cancer cells

Cell migration inducing hyaluronan binding protein (CEMIP) is a hyaluronic acid binding protein, the abnormal elevation of which is suggested as a contributor in the carcinogenesis of colorectal cancer (CRC). Cancer cells lose their adhesive properties and acquire an enhanced mobility by undergoing epithelial-mesenchymal transition (EMT). This study is performed to investigate whether and how CEMIP orchestrates the EMT process of CRC cells. To avoid the unexpected off-target effects possibly caused by one single shRNA, two shRNAs targeting different mRNA regions of CEMIP gene were used to knock down the mRNA and protein expression of CEMIP. Our data showed that the proliferation, migration and invasion of two CRC cell lines, HCT116 and SW480 cells, were inhibited by CEMIP shRNA. We here defined EMT as the complete or partial loss of E-cadherin and zona occludens protein 1 (ZO-1) (epithelial markers) and the gain of Vimentin and N-cadherin (mesenchymal markers), and found that the EMT process was attenuated in CEMIP-silenced SW480 cells. Snail, a direct target of β-catenin/T cell factor complex, is known to activate the EMT program during cancer metastasis. CEMIP shRNA was further found to suppress the Wnt/β-catenin/Snail signaling transduction in CRC cells as manifested by the decreased nuclear β-catenin and Snail. Collectively, our work demonstrates that CEMIP contributes to metastatic phenotype of CRC cells in vitro.     

间充质干细胞条件培养液促进肺癌细胞上皮间质转化

BACKGROUND: The complex relationship between bone marrow mesenchymal stem cells and cancers severely limit the clinical application of mesenchymal stem cells. So it is urgent to study the role of mesenchymal stem cells in tumor growth and metastasis. OBJECTIVE: To explore the effect of human bone marrow mesenchymal stem cells on epithelial mesenchymal transition in non-small cell lung cancer A549 and PAa cells. METHODS: The A549 and PAa cells were cultured with mesenchymal stem cell supernatant (mesenchymal stem cell conditioned medium, MSCs-CM). The cellular morphology was observed under a microscope. The mRNA and protein expression of E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Slug, Snail, and Twist were determined by RT-PCR and western blot. Transwell and wound healing assay were used to detect the change of migration and metastatic ability. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the cellular morphology of experimental group showed mesenchymal-like changes. In response to MSCs-CM, there was decreased E-cadherin but increased N-cadherin, Vimentin and Slug, Snail, Twist at mRNA and protein levels compared with the control group (P < 0.05). The migration and metastatic abilities of the experimental group were also increased. So, human bone marrow mesenchymal stem cells can promote epithelial mesenchymal transition in A549 and PAa cells, and enhance the migration and metastatic abilities of A549 and PAa cells.       

小分子干扰RNA 沉默RhoGDI2 基因表达对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及其机制

目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)沉默RhoGDI2 基因的表达,初步探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。方法:分别运用Western blot 和RT-qPCR 检测结肠癌细胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116 基因RhoGDI2 的表达情况。设计并合成RhoGDI2 siRNA 干扰序列,按照LipofectamineTM2000 转染方法将siRNA 干扰序列转染到目的细胞,设置实验干扰组、空白对照和阴性对照组;CCK-8 实验检测细胞增殖能力,细胞划痕试验和Transwell 实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果:人结肠癌细胞株RhoGDI2 表达量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116;RKO 细胞siRNA干扰后RhoGDI2 表达抑制率大于70%:实验干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞增殖率分别是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05;实验干扰组细胞迁移、侵袭速率较对照组均减慢。沉默RhoGDI2 基因的表达,实验组细胞E-Cadherin 较对照组表达量高,Vimentin 蛋白表达下降。结论:结肠癌RhoGDI2 基因沉默可能通过抑制EMT 进程阻止肿瘤恶性生物学行为。