Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用

目的: 探讨Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元中的作用。方法: 构建大鼠 Oct3/4慢病毒载体(Oct3/4 -LV)并感染大鼠MSCs;实验分为感染组(感染 Oct3/4 -LV)、阴性对照组(感染FU-PGC-NC-LV)和未感染组3组;采用β-巯基乙醇诱导各组大鼠MSCs分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs感染后形态学变化;MTT法检测细胞存活率;免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白 2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和Oct3/4的表达变化;Western blotting法检测MAP-2和Oct3/4蛋白的表达变化;RT-PCR法检测MAP-2和Oct3/4 mRNA的表达变化。结果: (1)阳性克隆PCR证明大鼠 Oct3/4 慢病毒载体构建成功,孔稀释法测定病毒滴度为2×10¹¹ TU/L。(2)倒置显微镜下观察大鼠 Oct3/4 慢病毒载体感染成功,感染复数(MOI)值为10,感染48 h时感染率最高,荧光表达最强;感染率可达83.4%±2.2%。感染组中,MSCs形态发生变化;MTT提示感染组细胞存活率显著降低(P<0.05)。(3)β-巯基乙醇可以诱导大鼠MSCs向神经元分化,其中以感染组诱导效果最佳,具有比较典型的神经元形态,NSE和MAP-2的表达率与其它各组相比显著增高(P<0.05)。(4)感染组与其它各组同时点的Oct3/4表达相比均显著增高(P<0.01)。并且随着诱导时间的延长,各组Oct3/4表达持续减少,诱导后5 h与诱导前相比存在显著差异(P<0.05)。结论: Oct3/4在大鼠MSCs分化为神经元的过程中可能起到了重要的调控作用。     

Let-7d慢病毒载体体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞

背景:微小RNA在生命体生长、衰老的过程中起着重要的作用,了解微小RNA let-7d家族成员对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以对干细胞移植起促进作用。目的:探讨let-7d慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:1构建大鼠慢病毒载体并感染大鼠骨髓间充质干细胞;实验分为未转染组、阴性对照组(感染空白慢病毒)、转染上调组(感染let-7d-LV)、转染下调组(感染let-7d-inhibition-LV)。2采用法舒地尔诱导转染后大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,以免疫细胞化学染色检测NSE、MAP-2的表达变化;RT-PCR检测MAP-2mRNA的表达变化;MTT法检测细胞存活率。结果与结论:倒置荧光显微镜下观察let-7d慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其中转染上调组的诱导效率与阴性对照组相比升高,NSE、MAP-2表达率上升(P0.05);转染下调组的诱导效率与阴性对照组相比下降,NSE、MAP-2表达率下降(P0.05)。结果表明let-7d慢病毒载体可以促进骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化,通过控制let-7d的表达可以影响骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化效率。     

骨髓基质干细胞诱导成神经元样细胞分化相关基因的表达

目的:分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法:用β-巯基乙醇诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后8 h,提取诱导前后的骨髓基质干细胞mRNA,进行微管相关蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中间丝nestin和神经丝(NF)基因的RT-PCR,观察其诱导前后的表达。结果:NSE在诱导前后均有表达, MAP-2、GAP-43、nestin和NF诱导前无表达, 诱导后有表达。结论: 骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化与MAP-2、GAP-43、nestin和NF可能有关。     

Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的表达变化及意义

目的: 探讨锌指蛋白521(Zfp521)在大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元过程中的表达变化及意义。方法: 体外培养大鼠MSCs,实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Zfp521-siRNA)和阴性对照组(转染negative control siRNA),采用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况。采用免疫细胞化学法、RT-PCR法及Western blotting法检测诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达情况及诱导前、后Zfp521的表达变化。结果: (1)siRNA转染72 h荧光表达最强,转染率可达84.1%±2.3%,转染组骨髓间充质干细胞的Zfp521 mRNA表达下降(P<0.05);(2)β-巯基乙醇可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元,以转染组诱导效果最佳,NSE和MAP-2表达显著高于其它各组(P<0.05);(3)Zfp521在各组细胞中均有表达,诱导后Zfp521表达明显低于诱导前(P<0.01)。结论: Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中表达下降,抑制Zfp521表达可促进神经元的分化,提示Zfp521在骨髓间充质干细胞的神经分化中可能发挥重要调控作用。     

氯化锂通过调节自噬通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:研究氯化锂(Li Cl)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)神经分化的影响,并探讨自噬通路在其中的作用。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞分为Li Cl组和对照组,采用β-巯基乙醇诱导MSCs向神经细胞分化,免疫荧光法和Western blot法检测诱导后神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化。进一步采用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预自噬,Western blot法观察NSE和MAP-2的表达变化。结果:诱导分化后,Li Cl组及对照组细胞均有NSE和MAP-2表达,Li Cl组细胞NSE和MAP-2蛋白阳性表达率及表达量均大于对照组(P0.05);此外,Li Cl组细胞LC3阳性荧光点以及LC3-Ⅱ表达量亦多于对照组(P0.05)。加用雷帕霉素可进一步促进Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05),而3-MA则抑制Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05)。结论:氯化锂可能通过调节自噬通路促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

阿尔茨海默病小鼠模型中骨髓间充质干细胞的神经分化

 目的：探讨淀粉样前体蛋白（APP）转基因小鼠（阿尔茨海默病小鼠模型）骨髓间充质干细胞（MSCs）的神经分化及其与参与调节干细胞分化的Notch1信号通路的关系,观察分化的骨髓间充质干细胞中自噬的变化。方法：实验分为APP转基因小鼠组（APP组）和野生型小鼠组（WT组）。采用β-巯基乙醇诱导小鼠MSCs分化为神经细胞;采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测诱导后β淀粉样蛋白40（Aβ40）和42（Aβ42）的水平;采用免疫细胞化学染色法和Western blotting检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白2（MAP-2）的表达变化;Western blotting检测Notch1、Notch胞内域（NICD）和Hes5的水平。结果：与野生型小鼠相比,APP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞具有更强的神经分化能力、更高的Aβ表达及更强的Notch1信号抑制。但是,自噬作为神经细胞存活和神经功能必不可少的条件,在分化后的APP 转基因小鼠来源的MSCs中受损。结论:过表达APP可能通过抑制Notch-1信号通路增强小鼠骨髓间充质干细胞神经分化的能力,而分化后的APP转基因小鼠MSCs出现自噬通路异常。     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

Caveolin-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:探讨caveolin-1在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-caveolin-1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1control siRNA)及阴性对照组(转染negative control siRNA)4组。采用β-巯基乙醇诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测caveolin-1和促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测caveolin-1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:(1)siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达(81.5±2.8)%;而且转染组MSCs的caveolin-1mRNA转录下降(P0.05);MTT提示转染组细胞存活率无显著变化(P0.05)。(2)β-巯基乙醇可以诱导MSCs向神经细胞分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著高于其它各组(P0.01)。(3)随诱导时间延长,各组caveolin-1表达持续增加,诱导6d达到峰值,与诱导前、诱导6h相比有显著差异(P0.05)。此外,转染组与其它各组同时点的caveolin-1表达均显著降低(P0.01)。结论:以caveolin-1为标记蛋白的脂筏在MSCs诱导分化为神经细胞中可能起到重要的调控作用。     

不同诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用

目的 观察体外不同诱导方法对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的作用.方法 体外培养、扩增骨髓MSCs,分别采用化学诱导剂(2-巯基乙醇 二甲基亚砜)和生物诱导剂,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学方法对诱导后的细胞进行鉴定和诱导率分析.应用组织学方法显示尼氏体.结果 倒置显微镜下可见,MSCs经两种方法诱导48h后,细胞均向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NF,不表达GFAP.化学诱导剂组NSE阳性细胞率为86.9%,NF阳性细胞率为85.6%;生物诱导剂组NSE阳性细胞率为88.2%,NF阳性细胞率为86.8%,两组间无显著差异(P＞0.05).硫堇-伊红染色显示胞体内有大量的尼氏体.结论 体外两种诱导方法均可诱导大鼠骨髓MSCs分化为神经细胞.     

初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的:研究初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法:全骨髓贴壁法分离、培养、纯化MSCs.含15 μmol/L白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫印迹检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.免疫荧光法检测MSCs增殖情况.扫描电子显微镜检测MSCs表面初级纤毛,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-Tu)的表达.结果:白藜芦醇诱导后60％的细胞胞体收缩,立体感增强,类似神经元.免疫印迹显示MSCs及对照组细胞有NSE蛋白的轻度表达,诱导后NSE、MAP-2蛋白表达阳性,随着诱导时间延长,NSE、MAP-2的表达渐增强.经过24 h饥饿后,90％的MSCs处于生长静止状态.扫描电子显微镜及免疫荧光显示,处于生长静止期的MSCs具有初级纤毛,且白藜芦醇可诱导具有初级纤毛的MSCs分化为神经元样细胞.对照组则无明显变化.结论:白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞.在此过程中,初级纤毛可能发挥着重要作用.     

BDNF诱导骨髓间质干细胞分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系

目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系。 方法： 分别用BDNF和β-巯基乙醇（β-ME）诱导MSCs分化为神经元样细胞，在诱导1 h、6 h、12 h及24 h后用蛋白质印迹法检测神经元特异性蛋白（nestin、NSE、MAP-2及GFAP）的表达，同时用流式细胞仪检测各时点的细胞生长周期及细胞凋亡。 结果： 蛋白质印迹法结果显示β-ME和BDNF诱导的细胞均能表达神经元特异性蛋白：nestin和NSE，不表达MAP-2；神经胶质细胞特异性蛋白GFAP也有较弱表达。β-ME组诱导12 h后nestin的表达转为阴性，NSE表达也减弱，而BDNF组直至24 h nestin和NSE表达才渐转阴性；BDNF诱导的细胞S期百分率均较同时点的β-ME组高，β-ME在诱导后12 h出现了凋亡峰，BDNF诱导组在观察的时点内均未出现凋亡峰。 结论： β-ME诱导细胞的神经元特异性蛋白表达的减少与细胞凋亡在时间上一致，说明分化后细胞死亡的原因可能与凋亡有关；而BDNF诱导细胞的蛋白表达减少与细胞凋亡无关，提示BDNF诱导分化后的细胞死亡可能还与其它因素有关或者BDNF可能有抗凋亡作用。     

重组质粒pcDNA3-β-NGF的构建及其转染小鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的研究*

 目的：构建人神经生长因子β亚基(β-NGF)真核表达载体,转染荧光小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学活性。方法：全骨髓贴壁培养法分离、培养和纯化荧光小鼠MSCs,构建真核表达载体pcDNA3-β-NGF,并转染MSCs;免疫组织化学染色检测β-NGF的表达,观察β-NGF阳性的MSCs对小鼠海马神经元生长的作用。结果：荧光小鼠MSCs可发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。重组质粒pcDNA3-β-NGF转染MSCs后β-NGF阳性率为(37.12±2.14)%,高于MSCs组［(2.36±0.62)%］和空白对照组［(1.43±0.76)%］,差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF转染MSCs上清液培养的新生小鼠海马神经元的突起长度［(31±3)μm］较pcDNA3转染MSCs组［(23±4)μm］明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明β-NGF基因转染MSCs培养上清液中的产物能促进小鼠海马神经元的突起生长,具有明显的生物学活性。结论：成功构建了pcDNA3-β-NGF真核表达载体,其转染的荧光小鼠MSCs能正确、稳定表达和分泌有生物学活性的β-NGF。     

腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达

目的:研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法: 在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞(rMSC), 用细菌同源重组法构建巨细胞病毒(CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因腺病毒载体(pAd-EGFP), 用293包装细胞制备腺病毒, 用EGFP重组腺病毒感染rMSC, 观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况, 用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导Ad-EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果:Ad-EGFP可高效感染rMSC, 感染率为(36±2)%, 而脂质体法转染质粒pTrack-GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功;Ad-EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到β-巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶(NSE), 表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论:腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率, 腺病毒载体介导的EGFP基因能够示踪rMSC分化为神经样细胞的过程。