基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测蛋白质分子量的优化研究

【目的】研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测蛋白质分子量的优化条件。【方法】选择3种不同的基质检测牛血清白蛋白（BSA）的分子量,在选定最佳基质化合物的基础上,通过改变样品蛋白质的浓度,以获得高质量的质谱峰图,确定蛋白质样品的最小和最优检测量。【结果】1 μg蛋白质样品与10 mg/mL含0.1%乙酸（TFA）和50%乙腈（ACN）的芥子酸（SA）基质水溶液混合检测分子量,可产生最高质量的MALDI-TOF-MS峰图,同时蛋白质样品最小检测量应不少于500 ng。【结论】MALDI-TOF-MS技术操作简单、分析快速、灵敏度高,是一种检测蛋白质分子量的可靠方法;研究结果确定了获得最优化质谱峰的最佳组合,这是从高度复杂的蛋白质样品测定准确分子量的必备条件。     

牛精子蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定初步研究

通过建立牛精子双向电泳-质谱鉴定研究平台,为从蛋白质水平研究精子生理机能奠定技术基础;采用改进的热TRIzol法裂解精子细胞制备蛋白,应用双向凝胶电泳(2-DE)分离牛精子蛋白,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质点.得到了重复性较好的牛精子2-DE图谱,质谱鉴定16个蛋白质点.建立牛精子双向电泳-质谱鉴定研究平台,为后续牛精子X、Y差异蛋白点的检测和分析奠定了理论和技术基础.     

基于MALDI-TOF/TOF技术的单增李斯特菌四种血清型的快速鉴别

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

种蛋孵化早期蛋黄蛋白质组学比较分析

卵黄为发育胚胎提供脂肪、蛋白质等营养物质,直接影响胚胎发育。研究旨在探索胚胎发育早期卵黄蛋白质变化,采用2-DE结合MALDI-TOF MS/MS分析孵化0和10 d种蛋卵黄蛋白质组成。共鉴定出代表10种蛋白质的57个蛋白点丰度存在显著差异(P<0.05),其中8个蛋白点仅存在于0 d卵黄;24个蛋白点仅存在于孵化10 d卵黄;另有25个蛋白点共同存在于0和10 d卵黄中,其中9个点丰度上调、16个点丰度下调。首次检测出卵黄膜外层蛋白1存在于胚胎孵化0和10 d卵黄中。2-DE凝胶图像分析表明,39个蛋白质相对分子质量低于其理论值。生物信息学富集分析表明,4种蛋白质与脂质转运和脂质定位有关,2种蛋白质与抗原结合有关。孵化10 d后卵黄差异蛋白主要参与脂质转运以维持胚胎发育。研究结果有助于进一步了解卵黄蛋白质对胚胎发育的调控机理。     

基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化.结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕...     

渗透胁迫诱导转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯根系差异蛋白质组学研究

【目的】利用蛋白质组学手段,研究短期渗透胁迫条件下,转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系蛋白质的表达差异。【方法】以水培转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系为材料,用100g/L PEG6000渗透胁迫处理24h,以未胁迫的NT为对照,提取根总蛋白,进行双向电泳分离,考染法凝胶染色,扫描凝胶图像用于软件检测。【结果】在T、NT和对照中分别检测到836,812,881个蛋白点;t测验发现,与对照相比,T和NT有34个蛋白点丰度发生1.5倍以上显著变化(P<0.05,Fold>1.5,Quality>80)。经基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,34个差异表达蛋白点中23个得到了有效鉴定。在鉴定的23个蛋白中,有10个蛋白在T和NT中共同上调或下调表达,包括ATP合酶F1β亚基、烯醇酶、26S蛋白酶体调节亚基6、ACC合成酶2等;另外13个蛋白在T和NT中表达各异,包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶结合蛋白β亚基和蔗糖合成酶等。【结论】10个在T和NT中共同上调或下调表达的蛋白,是甘薯应答渗透胁迫的普遍应答蛋白,反映了T和NT根系对短期渗透胁迫共同的响应机制;另外13个在T和NT中表达各异的蛋白,表明转基因使甘薯根系蛋白质在短期渗透胁迫下表现出特异的响应机制。     

反刍动物饲料产品和动物源性饲料产品中牛羊源成分检测

利用聚合酶链式反应法(PCR法)对反刍动物饲料产品(预混料、精料补充料、全价配合料等)和动物源性饲料产品(鱼粉、肉粉等)共计350个样品进行了牛羊源成分检测.结果表明,有3个样品检出牛和/或羊源性成分,牛羊源性成分检出率0.86%.其中,反刍动物饲料产品310批次,牛羊源性成分检出率为0.97%;动物源性饲料产品40批次,均未检出牛羊源性成分.     

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法鉴定检疫性病菌炭蛆菌

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS),对样品处理过程中的各条件进行优化,建立了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱快速鉴定炭疽菌的方法。炭疽病菌菌丝采用70%甲酸:100%乙腈(1∶1)进行提取、50μL70%甲酸∶100%乙腈(1∶1)重悬后再超声提取,然后以HCCA为基质,乙腈∶三氟乙酸∶无菌去离子水(50%∶2.5%∶47.5%)为基质溶剂,运用改进的干滴法点样,进行MALDI-TOF-MS分析。应用此方法获得了咖啡浆果炭疽病菌特有的9个蛋白图谱峰,建立12种炭疽菌的蛋白指纹图谱库,从而建立MALDITOFMS分析炭疽菌的标准方法。     

广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中牛羊源性成分监测

为了监测广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中的牛羊源性成分,掌握动物饲料安全情况,农业部饲料质量监督检验测试中心（南宁）于2005～2009年,应用实时荧光PCR和PCR对广西南宁、柳州、防城港、北海、钦州、桂林等市974批反刍动物饲料及动物源性饲料产品进行牛羊源性成分的抽样检测。结果表明,2005～2006年共有12批产品被检出含有牛羊源性成分,其涉及所有抽检产品类别和饲料生产、经营、使用3个环节;2007—2009年的抽检合格率均达100％。说明广西的反刍动物饲料和动物源性饲料的牛羊源性成分呈现下降趋势,反刍动物饲料逐步转向安全生产及使用的方向发展。     

动物源性食品中呋喃唑酮及其代谢物的检测

简述了呋喃唑酮主要代谢物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的稳定特性和致癌特性,介绍了动物源性食品中呋喃唑酮残留物原药分子和代谢物AOZ的检测技术,指出我国相关检测标准的不足,提出以检测代谢物来反映硝基呋喃类的真实残留量,并对今后我国呋喃唑酮的监管工作提出建议。     

猪源性成分的PCR检测技术优化研究

为确定食品和饲料中的猪源性成分,本试验优化了PCR检测猪源性成分的反应体系.试验采用20 μl的PCR反应体系,分别测定Taq DNA聚合酶为0 U、1 U、2 U、3 U时;25 m mol/L的MgCl2为0、2、4、6μl时;dNTP为0、0.1、0.2、0.4μl时,其他PCR反应因素为最大量的结果.结果表明:优化的猪源性成分PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、dNTP适宜浓度分别为2 U,2μl,0.4μl.优化后的反应体系对猪肉DNA最低检测浓度为0.04ng/μl.本研究优化出的猪源性成分PCR反应体系经二重PCR反应技术进行验证,不仅快速,简便,准确性与灵敏度高,并且经济、高效.     

ELISA方法检测动物源性食品中卡那霉素研究

为评价卡那霉素检测试剂盒的现场应用效果,结合仪器检测方法,对现场采集的样品同时进行HPLC-MS检测和ELISA检测,然后进行统计分析。结果表明,卡那霉素HPLC-MS检测和ELISA检测动物组织和肝脏样品816份,ELISA检测试剂盒检出率较高,与仪器的符合率达98.99%,卡那霉素ELISA检测试剂盒敏感性好、时间短,不存在假阴性。卡那霉素ELISA检测试剂盒可以用于动物源性食品的检测工作,适用于现场、大范围的快速筛选。     

动物源性食品外源性有害残留检测技术研究

外源性有害残留检测一直是动物源性食品安全领域致力解决的重要问题.通过对近年来外源性有害残留检测新技术,包括多残留组分同时检测技术、未知残留组分检测技术、重金属快速检测技术、低成本免疫快速检测技术、痕量残留组分定量准确检测技术,以及高效的前处理技术在动物源性食品安全中的应用进行探讨,以期为外源性有害残留检测技术的有效应用...     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪在家蚕蛋白质组中的应用

随着家蚕基因组全序列框架图的完成,家蚕蛋白质组学研究也就成了当前家蚕研究的主要方向之一。而双向电泳技术和质谱技术的发展为大规模研究家蚕蛋白质组提供了强有力的平台。近年来,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在蛋白质组学研究中的应用日益广泛,为此着重对其在家蚕蛋白质组学研究中的应用进行探讨。     

色谱法检测动物源食品中磺胺类药物残留研究进展

磺胺类药物是一类可限量使用于水产养殖和畜禽业的广谱高效抗菌药物,且被广泛应用.磺胺类在动物源性食品中会有残留,通过任何途径摄入磺胺都有可能在人体内蓄积而对人造成危害.目前,动物源性食品中磺胺类药物多残留的定量检测主要有高效液相色谱法(HPLC)以及高效液相串联质谱法(HPLC-MS-MS).色谱法检测磺胺类药物的主要步骤为提取、浓缩、净化和进色谱柱分析.简要综述了色谱法检测动物源食品中磺胺类药物的方法研究进展,以期为动物源性食品中磺胺类药物多残留检测提供参考.     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

飞行时间质谱在植物源农产品质量安全检测中的应用

我国是一个农业大国,农产品质量安全问题不仅影响着我国人民的健康和安全,还影响着我国国民经济的发展,因此,农产品质量安全问题备受关注.目前,农产品的检测分析技术主要有快速免疫分析法、光谱法、色谱法、质谱法等.随着人们对农产品质量安全问题认识的深入及污染物种类的多样化,对农产品检测技术提出了更高的要求.     

动物源性食品中多兽药残留检测方法的研究进展

动物源性食品中兽药残留已成为日益突出的问题,因此检测并监控动物源性食品中的兽药残留具有重要的意义。就近年来国内外动物源性食品中兽药残留检测的前处理方法和分析技术展开了探讨和分析,为兽药残留检测方法的开发提供一定的参考和依据。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系的花药差异蛋白质组学研究

 【目的】对大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其同型保持系NJCMS1B的二胞花粉期花药进行差异蛋白质组学研究，探讨大豆质核互作雄性不育的分子机制。【方法】采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离，凝胶用考马斯亮蓝染色，使用PDQuest软件分析蛋白质图谱，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行质谱分析，获得肽质量指纹图谱，用Profound和Mascot软件搜索NCBInr数据库，初步鉴定差异表达蛋白并分析其功能。【结果】 在分子量18.4～116.0 kD、等电点4～7线性范围内，检测到约212个蛋白点，差异表达蛋白点24个。其中10个在NJCMS1A 中出现而在NJCMS1B中缺失，12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现，2个表达量在NJCMS1B中比在NJCMS1A中明显增强。鉴定出11个差异表达蛋白，其中7个在NJCMS1A中出现而在NJCMS1B中缺失，4个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现。【结论】对主要差异表达蛋白如ACC氧化酶、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白、淀粉分枝酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等进行功能分析，推测不育系NJCMS1A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、乙烯过度合成、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。