特异性siRNA抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6基因的表达

目的:研究RNAi技术抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6癌基因的表达以及对细胞生物学特性的影响。方法:构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1/E6(PS6)重组质粒,脂质体转染细胞后用半定量RT-PCR技术检测CaSKi细胞中E6mRNA水平的变化,然后用western blotting检测RNA干扰前后p53和p21蛋白的表达来验证RNAi效应。用透射电子显微镜观察CaSKi/PS6细胞形态变化;应用流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,最后利用细胞计数和裸鼠成瘤实验测定CaSKi/PS6细胞增殖能力。结果:成功构建了真核细胞表达特异性siRNA的PS6重组质粒;在RNA干扰24、48和72小时后CaSKi/PS6细胞中E6mRNA分别下降了21.50%、52.60%和65.60%;CaSKi/PS6细胞出现凋亡的特征性改变;RNA干扰24h、48h和72h后CaSKi/PS6细胞的凋亡率分别为27.94%、31.95%和56.63%,细胞生长周期停滞于S期。结论:应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗和干预性预防提供了新的方法。     

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6基因的表达

目的：研究RNAi技术抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6癌基因的表达以及对细胞生物学特性的影响。方法：构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1/E6（PS6）重组质粒,脂质体转染细胞后用半定量RT-PCR技术检测CaSKi细胞中E6mRNA水平的变化,然后用western blotting检测RNA干扰前后p53和p21蛋白的表达来验证RNAi效应。用透射电子显微镜观察CaSKi/PS6细胞形态变化;应用流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,最后利用细胞计数和裸鼠成瘤实验测定CaSKi/PS6细胞增殖能力。结果：成功构建了真核细胞表达特异性siRNA的PS6重组质粒;在RNA干扰24、48和72小时后CaSKi/PS6细胞中E6mRNA分别下降了21.50%、52.60%和65.60%;CaSKi/PS6细胞出现凋亡的特征性改变;RNA干扰24h、48h和72h后CaSKi/PS6细胞的凋亡率分别为27.94%、31.95%和56.63%,细胞生长周期停滞于S期。结论：应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗和干预性预防提供了新的方法。     

针对HPV16E7基因的RNA干扰对CaSKi细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰抑制HPV16 E7基因对宫颈癌细胞系CaSKi细胞生物学特性的影响.方法:用脂质体将pGENESIL-1/E7(PS7)转染CaSKi细胞内,用透射电子显微镜观察细胞形态变化;细胞计数法测定细胞增殖能力的变化;流式细胞仪测定DNA含量来检测细胞是否发生特征性的凋亡;最后比较细胞裸鼠的成瘤能力.结果:透射电镜显示,凋亡细胞体积变小,细胞核染色质浓缩、趋边,细胞膜表面伪足消失,产生凋亡小体.流式细胞仪检测结果表明,RNA干扰24h、48h和72h后,CaSKi/PSN细胞的凋亡率分别为0.21%、0%、1.62%,CaSKi/PS7细胞的凋亡率分别为31.49%、28.95%、31.54%.生长周期停滞于S期;裸鼠荷瘤实验比较研究显示,RNA干扰后的CaSKi/PS7组的瘤结节体积、重量均较CaSKi/PSN瘤细胞显著降低 (P<0.05),CaSKi/PS7组的平均抑瘤率为55.4%.结论:本研究为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗、信息分子药物的开发和干预性预防提供了新的资料和方法.     

靶向切割HPV16E6 mRNA的核酶诱导宫颈癌细胞CaSKi凋亡的研究(英)

背景与目的:人乳头瘤病毒与宫颈癌的发生相关,核酶是一种能切割靶RNA的特殊RNA。本研究旨在探讨转染了靶向切割HPV16E6mRNA核酶的宫颈癌细胞株的表型,以及核酶对宫颈癌细胞增殖与调亡的作用。方法:计算机设计特异性切割HPV16E6mRNA的核酶,构建抗HPV16E6核酶(HRz)的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞。Northern杂交检测3种细胞中E6基因的表达。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率,将3种细胞在相差显微镜和荧光显微镜下观察,采用荧光(Hoechst33342)染色和TUNEL(TDT-mediateddUTPnickendlabeling)两种方法测定细胞凋亡。流式细胞术测定HPV16E6、c-myc、bcl-2、p53、Fas等蛋白的表达。结果:RNA点杂交证实核酶mRNA能稳定表达于CaSKi-R细胞中。Northern杂交证实CaSKi-R中E6mRNA表达水平较CaSKi细胞明显降低,而CaSKi-P和CaSKi细胞的E6mRNA表达水平无差异。CaSKi-R细胞凋亡率明显高于CaSKi和CaSKi-P细胞,细胞周期阻滞于G2期,S期细胞百分率下降。抗HPV16E6核酶能明显减少CaSKi-R细胞中HPV16E6、c-myc、bcl-2蛋白的表达,增高p53蛋白的表达;这种现象并不发生于CaSKi-P细胞中。Fas蛋白的表达在3种细胞中都相近。结论:抗HPV16E6核酶的导入能诱导宫颈癌细     

HPV18E6基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响

目的：观察RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达对宫颈癌Hela细胞牛长和凋亡的影响，探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法：针对HPV18E6 mRNA序列合成一对60bp的编码siRNA的DNA模板和一对60bp的非特异性对照DNA模板，构建pSUPER—siRNA和pSUPER—com重组质粒，瞬时转染Hela细胞；采用RT—PCR法检测质粒转染后细胞HPV18E6基因表达的变化，用蛋白免疫印迹法检测转染后Hela细胞p53、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达变化，以细胞计数法检测细胞生长情况，Hoechest／PI双荧光活细胞染色法检测细胞凋亡。结果：pSUPER—siRNA质粒转染能有效降低HPV18E6在mRNA水平的表达，转染后48小时，抑制效率达70％以上；转染后细胞053、p21和Bax蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达减少。RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达后，Hela细胞增殖受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加。结论：pSUPER—siRNA质粒转染可有效抑制HPV18E6在人宫颈癌Hela细胞中的表达，抑制Hela细胞生长并促进其凋亡。以HPV18E6为靶点的RNA干扰技术可望成为宫颈癌基因治疗的新途径。     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因shRNA真核表达载体构建及其对人宫颈癌SiHa细胞增殖及迁移能力的影响

目的 构建针对人乳头瘤病毒16型E6/E7基因的shRNA真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的人宫颈癌SiHa细胞系并探讨其对SiHa细胞增殖及迁移能力的影响。方法 合成3条特异性干扰HPV16 E6/E7基因的shRNA片段并定向插入psilencer 2.1-U6 hygro载体,构建重组质粒psilencer 2.1-U6hygro-shE6/E7并转染入人宫颈癌SiHa细胞, Real- time PCR检测转染后细胞E6/E7 mRNA的表达,选择沉默效应最好的重组质粒并用潮霉素B稳筛,获得稳定表达重组质粒的SiHa细胞,并用real time-PCR和Western blot方法进行鉴定;分别运用CCK-8细胞增殖实验和细胞划痕愈合实验检测细胞的增殖及迁移能力。结果　测序证实针对HPV16 E6/E7的shRNA真核表达载体psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7构建正确;转染psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达明显受抑,同时其增殖及迁移能力也明显受抑制。结论 psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7真核表达载体的成功构建并获得稳定沉默表达HPV16 E6/E7的人宫颈癌SiHa细胞系,证实沉默表达HPV16 E6/E7的SiHa细胞增殖及迁移能力会明显受到抑制,这为进一步研究HPV 16 E6/E7基因在宫颈癌发生发展过程中的功能奠定了实验基础。     

抗HPV16核酶对宫颈癌CaSKi细胞放疗敏感性的影响

背景与目的：人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV)是宫颈癌最主要的致病因素,E6是主要的致癌基因之一;高危HPV基因型,如HPV16的E6蛋白表达水平是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。而放射治疗是目前宫颈癌治疗的标准和有效的方法。本研究旨在探讨抗HPV 16E6核酶（ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞放疗敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV 16E6－ribozyme,空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测3种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对放疗的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测bcl-2,p53,bax蛋白表达。结果：点杂交证实核酶能在CaSKi－R细胞中,Northern杂交证实CaSKi－R中E6表达较CaSKi－P,CaSKi中明显降低。CaSKi－R细胞生长速度较CaSKi－P,CaSKi明显减慢（P＜0．01）,CaSKi－R细胞对X射线的敏感性较CaSKi－P,CaSKi明显增加,克隆形成率明显下降（P＜0．05）,CaSKi－R细胞照射前后的凋亡率较X射线照射后CaSKi－P,CaSKi明显增加（P＜0．01）;CaSKi－R细胞p53,bax蛋白表达较CaSKi－P,CaSKi明显升高,bcl-2明显减少（P＜0．01）。结论：转染抗HPV16E6－ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,且对放射治疗的敏感性增加。     

RNA干扰抑制HPV16E6基因的表达对HPV16阳性宫颈癌细胞中基因表达谱的影响

目的:探讨RNAi抑制E6基因的表达对宫颈癌细胞基因表达谱的影响.方法:利用脂质体将已验证有效的表达针对E6基因小发卡RNA(shRNA)的重组质粒转染到宫颈癌细胞CaSKi中,提取宫颈癌细胞总RNA并利用Agilent Human 1A寡核苷酸表达芯片检测RNAi后CaSKi细胞基因表达谱的变化,最后实时PCR检测CDKN2B(p15)和MKI67来验证芯片分析结果.结果:与CaSKi/PSN相比,共有2 765个基因表达有明显差异,其中有2 709个上凋基因(包括代谢相关基因、肿瘤抑制基因、信号转导相关基因、凋亡基因等)和56个下调基因(包括原癌基因、DNA结合和转录基因、代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞周期和发育相关基因等).实时PCR结果表明CDKN2B(p15)和MKI67的变化与基因芯片分析结果一致.结论:联合应用RNAi和基因芯片分析技术可以为研究HPV16 E6与宿主细胞相互作用分子机制提够更丰富的资料和信息,并提供新的研究策略和途径.     

特异性核酶诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的：研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法：设计特异性切割HPV16E6基因的核酶,构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。Northern杂交细胞3种细胞中E6基因的表达。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率,并测定HPV16E6,c-myc,bal-2,p53,fas等蛋白的表达。将3种细胞在相差显微镜和荧光显微镜下观察,采用荧光（Hoechst33342）染色和TUNEL（TDT-mediated dUTP nick end labelling）2种方法测定细胞凋亡。结果：Northern杂交证实CaSKi-P中表达E6较CaSKi-P,CaS-Ki明显降低。与CaSKi-R细胞表达HPV16E6,c-myc,bcl-2蛋白明显减少,而表达p53明显增高;两者中fas蛋白的表达相近。CaSKi-P细胞中各基因的表达与CaSKi细胞无显著差异。结论：抗HPV16E6-Ribozyme的导入能诱导宫颈癌细胞凋亡,其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低,以及由此而引起的细胞内一系列基因表达的改变。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞恶性表型的影响

目的：研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞恶性表型的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKiR， CaSKiP细胞。测定CaSKi，CaSKiR，CaSKiP 3种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率，流式细胞仪检测3种细胞中HPV16E6, PCNA, CerbB2蛋白的表达。将裸鼠分为3组，分别在皮下接种CaSKi，CaSKiR，CaSKiP细胞，检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力；另取一组裸鼠，每只在右侧接种CaSKi细胞，左侧接种CaSKiR细胞，对比这两种细胞的致瘤性。分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞恶性表型的影响。结果：CaSKiP，CaSKi细胞生长速率相近, CaSKiR细胞的生长速度明显降低。CaSKiR细胞的软琼脂克隆形成率明显低于CaSKi和CaSKiP细胞。与CaSKi细胞相比，CaSKiR细胞表达HPV16E6，PCNA，CerbB2蛋白明显减少，而CaSKiP细胞无此改变。CaSKi和CaSKiP在裸鼠体内的致瘤性无显著差异，而CaSKiR的成瘤性显著低于CaSKi。结论：抗HPV16E6核酶的导入能部分逆转宫颈癌CaSKi细胞株的恶性表型，其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低，以及由此而引起的PCNA，CerbB2基因表达的降低。