大豆和百脉根古老原核基因的全基因组鉴定与比较分析

在漫长的进化过程中,高等真核生物从原核生物中获取了大量基因,对这些基因进行鉴定分析,可为研究高等植物系统演化及基因组水平比较分析提供理论依据。为了进一步解析大豆和百脉根古老原核基因在其基因组中所起的作用及进化关系,本研究利用生物信息学技术对大豆和百脉根基因组古老原核基因进行全基因组鉴定,并对其特征及功能进行了比较分析。研究结果表明,大豆(40.6%)古老原核基因的占比高于百脉根(33.9%),且多分布于内共生细胞器线粒体、叶绿体中。此外,古老原核蛋白质的结构域在大豆和百脉根基因组中的分布相似,表明其在大豆和百脉根进化过程中具有较高的共线性和保守性。通过GO注释发现大豆与百脉根中古老原核蛋白主要分布在膜系统、细胞、细胞组分中。在分子功能上,大豆古老原核蛋白更多地参与代谢和发育过程,这可能与其接受了更多的人为选育有关。在生物过程中,古老原核蛋白更多参与催化反应和结合反应,主要以酶的形式在发挥作用。通过比较分析,本研究揭示了古老原核蛋白在大豆和百脉根中进化的独特模式,可为其他豆科植物基因组分析提供一定理论基础。     

大豆GmCYS20基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程。克隆了大豆的1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20,基因编码区全长为291 bp。氨基酸多序列比对分析发现,大豆GmCYS20蛋白与野生大豆cystatin蛋白相似性高达99%。构建GmCYS20基因的植物表达载体,通过发根农杆菌介导的百脉根发状根转化法获得转GmCYS20基因复合体植株,利用GUS染色和RT-PCR方法鉴定阳性发状根。复合体植株接种根瘤菌4周后,转GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照,结瘤指示基因的转录水平也呈上升趋势。进一步对接种10 d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。结果表明:GmCYS20基因通过促进根瘤的起始与发育,从而参与调控共生结瘤过程。研究结果可为揭示豆科植物与根瘤菌的共生互作机制提供新的分子生物学证据。     

大豆GmCYS20基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程。克隆了大豆的1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20,基因编码区全长为291bp。氨基酸多序列比对分析发现,大豆GmCYS20蛋白与野生大豆cystatin蛋白相似性高达99%。构建GmCYS20基因的植物表达载体,通过发根农杆菌介导的百脉根发状根转化法获得转GmCYS20基因复合体植株,利用GUS染色和RT-PCR方法鉴定阳性发状根。复合体植株接种根瘤菌4周后,转GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照,结瘤指示基因的转录水平也呈上升趋势。进一步对接种10d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。结果表明:GmCYS20基因通过促进根瘤的起始与发育,从而参与调控共生结瘤过程。研究结果可为揭示豆科植物与根瘤菌的共生互作机制提供新的分子生物学证据。     

谷子AGO基因家族全基因组鉴定及特征分析

阿尔戈蛋白（Argonaute proteins,AGO proteins）作为一种高度保守的RNA诱导沉默复合物,与基因转录和转录后沉默有关。目前,植物AGO基因功能的研究主要集中在拟南芥和水稻,对谷子AGO基因功能尚无文献报道。本研究利用生物信息学方法在谷子全基因组中鉴定出15个具有保守结构域和位置顺序的家族成员,分布在7条染色体上,其编码的蛋白质长度在862～1148 aa之间。系统进化分析显示,谷子AGOs蛋白分布在3个进化分支,与拟南芥相比,家族成员数量有所扩展;组织表达特异性分析表明,谷子AGOs大部分基因在穗部表达强烈,推测其参与生殖发育基因调控;蛋白互作结果预测显示,所有谷子AGOs蛋白都与三种蛋白质相互作用,其中DNA介导的RNA聚合酶v亚单位1已被证明与转录水平基因沉默有关。表明AGO基因在谷子进化过程中结构和功能保守,可为谷子AGO基因家族成员的功能研究提供理论基础。     

GA20-氧化酶基因转化豆科牧草百脉根的研究

以豆科植物百脉根子叶为转化受体，通过根癌农杆菌介导方法将外源目的基因GA20－氧化酶（GA20－oxidase)和NPTⅡ基因导入，经筛选分化，再生，得到具有卡那霉素抗性的转基因植物。在卡那霉素筛选浓度的选择中，25mg/L是百脉根较为适宜的筛选浓度。头孢霉素对农杆菌的抑制作用好于羧卞霉素。转基因植物移栽大田后生长良好。PCR检测证明外源目的基因已整合到百脉根基因组中。     

中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

本研究应用RT—PCR方法扩增到我国2005年-2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK／CH／LSD／05I与疫苗株H120同源性最高（93.4％）。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株（9株）分布于第1群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK／CH／LSD／05I存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年-2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol, TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点。为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因。根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族。同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因。基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应。这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1个1674bp的开放阅读框,编码557个AA,编码蛋白属于IIb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T0代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T1代转基因株系进行抗盐分析发现,在200mmol·L-1 NaCl处理14d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate?acyltransferase,?GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol,?TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程.蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点.为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因.根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族.同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因.基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应.这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础.     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

大豆根际促生菌的分离筛选及其对大豆和百脉根生长与品质的影响

从贵州毕节地区大豆根际土壤中分离溶磷菌株,从大豆根瘤中分离根瘤菌株。对分离出的溶磷圈直径与菌落直径的比值(D/d值)在2.20以上的溶磷菌株分别进行溶磷能力、生长素(IAA)及有机酸分泌能力、产酸产碱性能测定,筛选出优良溶磷菌4株;对分离出的根瘤菌通过大豆试管苗回接及促生效应试验,筛选出高效根瘤菌2株。将筛选出的6株菌经拮抗反应试验后分别按单一溶磷菌接种剂、单一根瘤菌接种剂、溶磷菌+根瘤菌复合接种剂3种处理制备菌悬液,采用盆栽方法分别对大豆和百脉根进行促生效应试验。结果表明,与对照相比,除单一根瘤接种剂对增加大豆株高无效果外,另外2个处理对大豆株高有提升效果,所有处理对大豆茎粗、生物量、结荚数、荚重、单粒数及单粒重都有明显的促进作用。其中溶磷菌+根瘤菌复合菌液对大豆株高、茎粗、幼苗地上生物量和地下生物量的促进效果最好,分别比对照高出21.26%,40.79%,15.88%和42.19%。3个处理对百脉根的第一、二茬株高及地上生物量、全氮、全磷和粗蛋白含量均有明显的提升效应,其中依然是溶磷菌+根瘤菌复合菌液的处理效果最好,分别比对照高出20.82%,54.88%,106.14%,148.78%,19.34%,61.88%和19.34%,与对照差异均达极显著水平(P<0.01)。说明所筛选的菌株组合能产生良好的促生互作效应。     

高羊茅在低氮胁迫下的蛋白组学分析

为了研究高羊茅在低氮胁迫条件下的蛋白水平变化,我们采用iTRAP技术分析了氮胁迫30 d的高羊茅叶片中蛋白组学的变化.一共检测到595个差异蛋白(295个上调,300个下调),分别参与了多个不同的代谢途径.在高严谨筛选标准下,氮代谢,氧化还原反应以及胁迫相关代谢等多个途径的基因被明显上调表达.通过生理生化测定发现,叶绿素,可溶性蛋白以及游离氨基酸的含量显著下降,而过氧化物酶(POD),超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等活性氧清除酶活性显著升高.采用荧光定量PCR的方法验证蛋白组学数据发现所有挑选的基因都具有相同的变化趋势.分析显著富集的14-3-3基因家族的表达,发现其都能被低氮胁迫诱导,因此胁迫相关的基因可能是调节高羊茅抵抗多种不同逆境的关键基因.本文首次在高羊茅中采用蛋白组学的方法分析低氮胁迫条件下基因的表达变化,获得重要候选基因,并对其应用进行了讨论.     

根癌农杆菌介导的1─磷酸甘露醇脱氢酶基因转化百脉根的研究

本文以百脉根子叶外植体为受体材料，通过根癌农杆菌介导的方法，导入外源目的基因1－磷酸甘露醇脱氨酶（mtlD）基因和npt－Ⅱ基因，建立了转化系统，获得转基因植株，转化频率为9．7％．转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大，再生成苗和植株。抗性植株的形态正常，移入盆栽后生长良好。PCR扩增与扩增产物的Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。     

The effect of birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus) and white clover (Trifolium repens) in mixed pasture swards on incoming and established nematode infections in young lambs

Lotus corniculatus L., a leguminous plant containing condensed tannins, is now being evaluated in Sweden as a component of mixed pastures. This is because of its high nutritive value, palatability, modest requirement for water, calcium and phosphorous and particularly because it has the ability to survive harsh weather conditions that typify northern Scandinavia. This trial was undertaken to assess the possible parasitological benefits of using L. corniculatus when fed as a minor component in a mixed pasture sward to young sheep. This was compared with similar sheep that were fed pasture with a comparable legume content consisting of Trifolium repens L. Separate groups of lambs, maintained in pens and provided with fresh pasture cuts containing either L. corniculatus or T. repens each day, were trickle-dosed with infective larvae of mixed parasite species. For each pasture type, groups of 6 lambs had either established worm burdens only, received incoming infections only, or had the combination of both adult and incoming infections. Worm burdens were monitored by serial faecal egg counts and at the termination of the study, all animals were slaughtered for worm recovery, identification and enumeration. The results showed that there were no differential effects between L. corniculatus and T. repens on the different stages of development for a range of nematode parasite species recovered from these lambs. Several reasons may account for this: such as the low level of condensed tannins in the L. corniculatus variety tested, the minor proportion of this plant in the diet and/or the variety of L. corniculatus used in this trial which do not provide any benefits to controlling parasites of sheep.     

Association of avian reovirus M and S genes with viral behavior in vivo. I. Viral persistence

Persistent infections were initiated in chickens with four different avian reovirus strains of varying virulence. Chickens 1 day old, 1 week old, or 2 weeks old were inoculated with each. Eight weeks later, isolates from all four parent strains were obtained; all isolates but one were from the tendons, and that was from the pancreas. Biochemical characterization of the isolates showed their genomes to be similar to those of the parent strains, although the proteins of the persistent isolates occasionally appeared to migrate differently from those of the original strains. Hybridization studies of the genes of the isolates indicated that at least two genes, S2 and S4, consistently seemed to undergo the greatest degree of mutation in the most virulent strain. These data suggest that the S2 and S4 genes may be associated with initiation and maintenance of persistent infection in vivo, and that changes in these genes may be noted by 56 days postinfection.     

Condensed tannins act against cattle nematodes

The use of natural plant anthelmintics was suggested as a possible alternative control of gastrointestinal nematodes (GIN) in ruminants. Direct anthelmintic effects of tannin-containing plants have already been shown in sheep and goat GIN. These anthelmintic properties are mainly associated with condensed tannins. In the present study, we evaluated possible in vitro effects of three tannin-containing plants against bovine GIN. Effects of Onobrychis viciifolia, Lotus pedunculatus and Lotus corniculatus condensed tannin (CT) extracts on Cooperia oncophora and Ostertagia ostertagi were determined by a larval feeding inhibition assay (LFIA) and a larval exsheathment assay (LEA). In the LFIA, all three plant extracts significantly inhibited larval feeding behaviour of both C. oncophora and O. ostertagi first stage larvae in a dose-dependent manner. The L. pedunculatus extract, based on EC(50) (effective concentration for 50% inhibition), was the most effective against both nematodes, followed by O. viciifolia and L. corniculatus. The effect of CT extracts upon larval feeding behaviour correlates with CT content and procyanidin/prodelphidin ratio. Larval exsheathment of C. oncophora and O. ostertagi L3 larvae (third stage larvae) was also affected by CT extracts from all three plants. In both in vitro assays, extracts with added polyvinylpolypyrrolidone, an inhibitor of tannins, generated almost the same values as the negative control; this confirms the role of CT in the anthelmintic effect of these plant extracts. Our results, therefore, indicated that tannin-containing plants could act against cattle nematodes.     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

9种豆科牧草总黄酮和总皂苷积累规律的研究

黄酮和皂苷不仅是植物中重要的防御性次生代谢产物,而且具有显著的药理和生理活性,对于植物的抗性研究和工业化应用具有重要意义。对鹰嘴紫云英(Astragalus cicer L.)、红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop)、百脉根(Lotus corniculatus L.)、小冠花(Coronilla varia L.)、黄花草木樨(Melilotus officinalis(L.)Desr.)和苜蓿(Medicago L.)多种豆科牧草中总黄酮和总皂苷的周年积累规律和分布特点进行研究,以期为豆科牧草建立科学的牧刈制度和合理应用提供理论依据。结果表明:总黄酮和总皂苷在不同属间和品种间的动态变化各不相同;在不同组织中的分布也不同,在整个生育时期,均为叶片中的含量多于茎秆中的。前5种豆科牧草的总黄酮含量显著高于苜蓿,是提取总黄酮的优质材料;红豆草、鹰嘴紫云英、黄花草木樨及苜蓿的总皂苷含量均高于小冠花和百脉根,是提取皂苷产品的优质材料。     

Cloning and expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus

To further evaluate the clinical impact of recombinant PoIFN-alpha/gamma, PoIFN-alpha/gamma genes from a Chinese domestic big-white porcine breed were cloned using PCR, and expressed in a high-level prokaryotic system. The antiviral activities of rPoIFN-alpha/gamma on vesicular stomatitis virus (VSV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and classical swine fever virus (CSFV) were investigated in different cell lines. The cloned PoIFN-alpha gene encodes a protein of 166 amino acids and has been named PoIFN-alphac. In a comparison of PoIFN-alphac with reported PoIFN-alphaI genes, eight amino acid substitutions at positions 43 (F to L), 78 (N to D), 86 (Y to C), 104 (A to V), 118 (R to L), 128 (T to P), 151 (S to V), and 156 (R to T) were observed, and resulted in no potential N-glycosylation site in the deduced PoIFN-alpha amino acid sequences. In contrast to PoIFN-alphac, one nucleotide substitution was found at position 462 (A to G), hence 0.1% synonymity is specific for the PoIFN-gamma gene. Both PoIFN-alphac and PoIFN-gamma genes were inserted into a prokaryotic vector pQE30, and expressed in E. coli M15 (pREP4) or SC11103 (pREP4) with the N-terminal six consecutive histidine residues, respectively. rPoIFN-alphac and rPoIFN-gamma proteins were detected by SDS-PAGE and Western blotting analysis at 20.7 and 18.0 kDa, respectively. In addition, the rPoIFN-alphac and rPoIFN-gamma protein were purified using Ni-NTA metal-affinity chromatography, and their anti-VSV, anti-PRRSV, and anti-CSFV activities were surveyed in homologous and heterologous cell lines. The results suggested that rPoIFN-alpha and rPoIFN-gamma could inhibit classical swine fever virus and other important viral pathogens in different cell lines.     

热激蛋白研究进展

热激蛋白(Heat Shock Protein)是生物体在多种刺激下产生的一种蛋白质。其特点是分布广泛、表达具有多样性。其生理功能主要起分子伴侣作用，维持生物体正常生理功能。热激蛋白基因的表达调控主要在转录水平上进行，但也有部分表现为翻译水平调控。其基因一般含有保守序列，根据序列的保守性和多样性可推断相应生物体在生物进化过程中的位置。同时本介绍了热激蛋白在体外表达的研究状况。