牦牛KAP1家族基因长度多态研究

试验旨在研究牦牛角蛋白关联蛋白1（keratin associated protein 1,KAP1）家族基因长度多态与重复序列特点。研究对牦牛和黄牛KAP1家族基因进行测序,并与绵羊已知序列进行比较分析。结果发现,牛KAP1家族位于19号染色体,根据绵羊KAP1家族基因在染色体上的位置与相似性,重新命名了牛KAP1家族基因B2D、B2A、KAP1-1和B2C为KAP1-4、KAP1-1、KAP1-2、KAP1-3（按照染色体上的基因顺序）。KAP1家族基因之间在3'和5'端区域高度保守,中间有重复序列长度差异,其中牦牛KAP1-KAP4基因发现有30 bp的长度多态。研究其蛋白序列发现5个氨基酸为基序的重复序列B（CCQTS）A₁（CCQPT）,以及一个新的重复序列C（SIQTS）。本研究结果说明重复序列是KAP1家族基因间和基因内的主要差异区域,这可能与其角蛋白结合螺旋数相关。     

HGT KAPs基因家族在辽宁绒山羊皮肤毛囊中的表达研究

为进一步探索高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白基因家族(HGT KAPs)与辽宁绒山羊羊绒品质——绒毛纤维直径的关系,本研究运用半定量RT-PCR检测KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1和KAP8.2在皮肤及各组织中的表达,通过原位杂交对其进行定位分析,采用实时荧光定量PCR检测兴盛期、退行期基因的相对表达量。结果表明:5个基因特异地表达于皮肤,在初、次级毛囊的皮质层、内根鞘中有明显的表达信号。KAP6-1.2和KAP8.1在兴盛期初次级毛囊的表达量差异不显著,KAP6.2在兴盛期、退行期初级毛囊的表达量均高于次级毛囊,而KAP7.1、KAP8.2在兴盛期次级毛囊的表达量高于初级毛囊,而退行期与之相反。因此推测,HGT KAPs基因家族在调控辽宁绒山羊绒毛纤维直径方面具有重要的作用,是编码羊绒结构蛋白的基因。     

KAP7-1基因在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达

角蛋白关联蛋白是羊绒主要的结构蛋白之一,依据氨基酸的成分,基本上可分为超高硫、高硫和富含甘氨酸/酪氨酸三种角蛋白家族.从构建的成年山羊皮肤cDNA文库和ESTs分析中发现了与绵羊KAP7-1cDNA高度同源的gKAP7-1cDNA,在核苷酸水平的同源性达到96.8%,编码85个氨基酸,甘氨酸和酪氨酸的含量为30.12%.在GeneBank中的注册号是AY510121.1,有3个拷贝数.原位杂交显示它在皮肤初级毛囊的皮质层、表皮层和次级毛囊的皮质层有强烈的表达.     

山羊KAP9.2基因多态性研究

KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2(KAP 9.2)是超高硫角蛋白相关蛋白基因家族中的一员,可能在连接中间微丝角蛋白中起重要作用.研究通过DNA测序和PCR-RFLP技术对KAP9.2基因进行了研究.结果表明:KAP9.2基因在286位存在T/C突变,该突变位点能够被Pst Ⅰ识别并切割,在785个内蒙古白绒山羊、212个陕北白绒山羊及239个奶山羊个体中均出现TT、TC、CC三种基因型,其频率分别为0.047,0.519,0.434;0.180,0.592,0.228;0.431,0.544,0.025 1.T和C的等位基因频率分别为0.307,0.476,0.703和0.693,0.524,0.297.X2检验表明3个山羊品种在KAP9.2位点上均处于HardyWeinberg不平衡状态(P＜0.05),T和C等位基因的频率在绒山羊和奶山羊中差异显著(P＜0.05),C等位基因为绒山羊的优势基因,揭示该等位基因可能与绒性状有关.     

KAP6基因家族成员在胚胎期山羊皮肤中的表达

为研究KAP6家族成员在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊胚胎期皮肤毛囊中的表达,在体外合成用地高辛标记的阿尔巴斯白绒山羊KAP6基因家族成员的cRNA探针,通过原位杂交法在山羊皮肤组织切片上进行定位,检测KAP6 mRNA在绒山羊胚胎期皮肤组织中的表达情况.结果发现,KAP6mRNA在初级毛囊和次级毛囊的皮质层有强烈的表达信号,表明KAP6是绒山羊毛和绒皮质蛋白的组成成分,是皮质层中起角质化作用的重要蛋白质,直接参与了绒毛和粗毛的合成,对毛发的理化性质有重要作用.     

绵羊毛发角蛋白结合蛋白启动子的克隆与活性分析

以绵羊基因组DNA为模板克隆获得绵羊角蛋白结合蛋白基因KAP6.1启动子。将KAP6.1启动子插入到切除了CMV启动子的pAcGFP1-N1质粒中,构建了重组真核表达载体,并采用脂质体法转染传代培养绵羊皮肤成纤维细胞并检测其表达活性。结果显示：（1）KAP6.1启动子序列大小为830 bp,与GenBank上绵羊角蛋白结合蛋白的参照序列（M95719）有99.64%的同源性;与M95719相比,KAP6.1在349位点、726位点和246位点上分别存在1个C缺失、1个转换（G代替A）和1个颠换（A代替T）;在438位点上具有1个依赖DNA的RNA聚合酶结合位点TATA box,但未发现具有依赖DNA的RNA聚合酶识别位点CAAT box;（2）转染24 h后,在蓝光激发下检测到细胞核附近有绿色荧光蛋白的高表达,并在48 h后逐渐减弱,而细胞质内绿色荧光蛋白的表达量增加。这一结果表明,KAP6.1启动子在绵羊皮肤成纤维细胞的表达上可能具有特异性。     

绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9基因的扩增及表达

本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin type Ⅱ intermediate filament 9,KIF Ⅱ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP6-1基因启动子,然后与RT-PCR扩增得到的KIFⅡ-9 cDNA 序列连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,将重组表达载体以脂质体介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因细胞克隆,结果显示,外源KAP6-1启动子序列和KIF Ⅱ-9 cDNA整合到细胞基因组中,为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊提供了条件。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8.1基因表达研究

本试验通过Real-time PCR研究辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白(KAP)8.1基因相对表达量,并与其他3个品种羊进行对比,从而明确角蛋白关联蛋白8.1基因对绒山羊皮肤毛囊发育及毛纤维品质的调控作用。结果表明,角蛋白关联蛋白8.1基因可在辽宁绒山羊皮肤毛囊内表达,相对表达量上调1.2倍。不同品种毛绒用羊角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量为:辽宁绒山羊南非肉用美利奴羊(♂)×东北细毛羊(♀)(简称南×东)南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称南×寒)东北细毛羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称东×寒)(毛纤维直径:东×寒南×寒南×东辽宁绒山羊)。由此可见,毛纤维直径越细,角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量越高。说明角蛋白关联蛋白8.1基因可能对辽宁绒山羊毛纤维的细度具有一定的调控作用。     

内蒙古绒山羊KAP4序列及结构的特征分析

选择内蒙古绒山羊KAP4 cDNA文库为研究材料,通过对不同物种KAP4核苷酸和氨基酸序列的比较分析,发现山羊KAP4的氨基酸序列与其它哺乳动物如人、绵羊的氨基酸序列有很多一致或保守的区域.通过对绒山羊KAP4蛋白的二级结构预测,发现绒山羊KAP4的二级结构中无规则线性长链结构所占比例最多,β-折叠结构占到了较少的部分,几乎没有发现α-螺旋的存在.     

西藏绒山羊KAP7.1和KAP8.2基因多态性及其对部分生产性状的影响

为分析西藏绒山羊角蛋白关联蛋白(KAP)7.1基因和8.2基因与生产性状的关系,采用PCR-SSCP和DNA测序技术对340只西藏绒山羊KAP7.1基因和KAP8.2基因编码区序列进行多态性分析,并与体长、体高、胸围、产绒量、羊绒长度、羊毛长度等生产性状进行关联分析。结果显示:PCR-SSCP检测发现KAP7.1基因只有1种带型,KAP8.2基因有6种带型;KAP7.1基因扩增产物序列中未发现碱基变化;KAP8.2基因扩增产物序列中存在5个SNPs位点,分别为C115T、A207G、A214G、G216A和A278T,除了A278T外都位于编码区;对KAP8.2基因的基因型1、基因型2和基因型3与生产性能进行关联分析发现,基因型1个体的胸深和产绒量显著高于基因型3个体(P<0.05)。结果表明:KAP8.2基因可作为影响西藏绒山羊胸深和产绒量的分子辅助选择标记。     

角蛋白关联蛋白基因3.1在绒山羊不同时期皮肤中的表达

本研究旨在揭示角蛋白关联蛋白基因对绒山羊绒毛生长的作用。通过RT-PCR技术对KAP3.1基因在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊不同时期皮肤中的相对表达量进行研究,结果表明:KAP 3.1基因在12个月的皮肤中均有表达,且表达量存在极显著差异(P0.01)。其中8、9、10月3个月的表达量极显著高于其他月份(P0.01);表达量在12个月中呈周期性波动,即从6月份开始逐渐增高至10月份;随后开始降低,4月份表达量达到最低值;预测KAP3.1基因对绒山羊绒毛生长及品质具有重要的调控作用。     

绵羊KAP8-1基因克隆与表达分析

本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。     

不同家畜品种毛绒角蛋白组分与相对含量分析

为了解不同家畜品种毛绒角蛋白的组成与差异,选择细毛羊、绒山羊、粗毛羊、羊驼、骆驼和牦牛的毛绒,利用还原法提取毛绒角蛋白,电泳分析其角蛋白的组分和相对百分含量。结果显示:细毛羊、绒山羊和粗毛羊都检出7种角蛋白组分,不同品种细毛羊角蛋白组分含量比较一致,低硫蛋白与高硫蛋白比例最大为3. 22,最小为2. 31;不同品种绒山羊角蛋白组分的相对百分含量差异较大,低硫蛋白与高硫蛋白比例最大为4. 18,最小为1. 52;不同品种粗毛羊角蛋白组分的相对百分含量差异也较大,低硫蛋白与高硫蛋白比例最大为6. 46,最小为3. 44;安哥拉山羊和羊驼分别检出5种和3种角蛋白组分;牦牛、骆驼都检出4种角蛋白组分,但是角蛋白组分的分子量大小不同。结果表明:毛发角蛋白组分和相对含量具有品种特异性,可为衣物中纤维的来源鉴别提供依据。     

和田羊毛囊KAP1.1基因的克隆及生物信息学分析

为了分析和田羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)1.1基因,试验以南疆地方品种羊(和田羊)为样本,从和田羊毛囊中提取总RNA,设计1对引物,通过PCR反应扩增出长度为535 bp的基因片段,连接到pMD18-T载体上。结果表明:克隆得到和田羊毛囊KAP1.1基因成熟蛋白编码序列,序列长度与GenBank上发表的序列长度相同,经生物信息学软件分析,有2处碱基发生突变,同源性为99%,说明试验成功克隆了KAP1.1基因。     

内蒙古绒山羊KAP 9-2 cDNA的特征分析

内蒙古绒山羊是自治区的优良家畜品种.选择内蒙古白绒山羊毛囊兴盛期角蛋白关联蛋白第九家族的一个成员gKAP9-2的cDNA序列为研究材料,进行了基因序列和氨基酸序列比对,并且对其空间结构和功能位点进行了预测,对于研究其他的角蛋白关联蛋白有重要的参考价值.     

中国羊驼KAP1．3基因的克隆及序列分析

毛纤维中的角蛋白（keratin）和角蛋白关联蛋白（keratin-associatedproteins）的数量遗传性状位点（quantitativetraitloci）已有学者在绵羊等一些动物身上找到，其中KAP1．1、KAP1.2、KAP1．3等基因作为候选基因来间接选择羊毛细度性状。而羊驼相关候选基因的研究还未见报道，本研究提取成年羊驼的新鲜血液中基因组DNA，并以此为模板采用PCIL技术扩增KAP1．3基因进行序列分析，测序后在NCBI工作平台中进行BLASTn同源性比较，得出结论：结果表明多个物种间KAP1．3基因编码区的序列相似性在73%以上。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图．并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。通过羊驼与绵羊在KAP1．3的氨基酸序列上的比较只有十五处残基的差异。证实KAP1．3基因与羊驼毛细度性状相关。     

内蒙古白绒山羊经济性状与候选基因分析

以120只内蒙古白绒山羊为研究对象,利用PCR-SSCP技术,选取编码羊毛纤维组成蛋白基因中KAP1.3和KAP6.1的部分序列作为候选基因,通过对其多态性的研究,探索将该基因作为候选基因来间接选择绒山羊经济性状的可行性.结果表明,应用分析软件中的单因素方差分析中,角蛋白辅助蛋白的多基因家族中的甘氨酸酪氨酸角蛋白辅助蛋白(KAP6.1)中,位点S2与产绒量有显著的相关性(P<0.05);多重比较发现S2住点的AA基因型和BB基因型与产绒量之间有显著的相关性(P<0.05);AB基因型和BB基因型的绒细度之间差异显著(P<0.05).     

新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7,KAP7）基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1：10 000。     

牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息学分析

本研究以牦牛的角蛋白关联蛋白3.3(KAP3.3)基因作为研究对象,通过查询GenBank中收录的黄牛KAP3.3基因的mRNA序列设计1对特异性引物,通过逆PCR、PCR以及基因克隆测序的方法首次获得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:牦牛KAP3.3基因的CDS区为297 bp,编码98个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白。二级结构含有延伸链、β转角以及无规卷曲3种。氨基酸序列与黄牛的完全一致,具有Keratin,high sulphur matrix protein家族的完整结构域。     

绵羊角蛋白Kap6.1启动子的克隆及活性检测

克隆绵羊角蛋白Kap6.1启动子,为下一步构建真核毛囊特异表达载体奠定基础。以绵羊基因组为模板,利用PCR方法克隆绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并用此启动子置换真核表达载体pEGFP-N1的原始启动子CMV,构建pKap-EGFP质粒,通过转染内蒙古阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞鉴定启动子活性。结果显示:克隆所获得的启动子序列与NCBI上发表序列匹配率为99.6%,启动子的特征序列CAAT框和TATA框完整,并且分别位于序列的921位和878位,pKap-EGFP质粒转染绒山羊成纤维细胞后Kap能启动GFP的表达,与对照组相比活性良好。本研究通过克隆获得了绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并观测到其能启动GFP在山羊胎儿皮肤成纤维细胞中表达。