Expression of human VEGF121 cDNA in mouse bone marrow stromal cells

目的构建人VEGF121逆转录病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性.方法采用分子克隆技术从pCDⅠ/VEGF121质粒获得hVEGF121cDNA, 并克隆到pLXSN逆转录病毒质粒.经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒, 并进行滴度测定.培养小鼠骨髓基质细胞,用重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞.经筛选后,用PCR及RT-PCR方法测hVEGF121cDNA在基质细胞中的整合及转录;用免疫印迹及免疫组化检测VEGF121蛋白的表达;用MTT检测转基因细胞培养上清中VEGF的促人内皮细胞增殖活性.结果经酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒正确,包装的病毒滴度为6×105.PCR证实基因组DNA有hVEGF121cDNA的整合;RT-PCR证实有hVEGF121mRNA的转录;Western blot及免疫组化检测有VEGF121蛋白的表达;MTT试验显示转基因细胞培养上清中VEGF121能促进人内皮细胞增殖.结论我们成功地构建了pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒载体,该载体不仅能够有效地表达VEGF121蛋白,且表达的蛋白具有促进人内皮细胞增殖的生物学活性,这些均为进一步应用该载体研究VEGF基因治疗骨科缺血性疾患打下了基础.     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性。将真核表达质粒pCD－hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线。结果发现：VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖。提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因。     

tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的：观察组织纤溶酶原激活物（tPA）和血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因共表达质粒在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞（VEC）和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐（MTT法）和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。     

VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

VEGF165和VEGF121在MC3T3-E1细胞中的表达及生物学功能

目的：构建一个能在MC3T3-E1细胞中稳定表达，并具有生物学活性的VEGF165和VEGF121基因表达载体。方法：采用RT—PCR技术从HL-60细胞中扩增人VEGF165和VEGF121基因，将获得的基因定向插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞。细胞经G418加压有限稀释筛选，采用ELISA法、Western blot法及免疫荧光法检测VEGF蛋白表达，并用MTT法检测表达的蛋白对血管内皮细胞株（HUECV304）的增殖活性影响。结果：通过基因测序表明获得的yEGF165和VEGF121与GeneBank登录的序列一致，构建的质粒分别为VEGF165／pcDNA3．1（＋）质粒和VEGF121／pcDNA3．1（＋）质粒，ELISA及Western blot检测结果均表明VEGF165和VEGF121基因转染MC3T3-E1后能在细胞中稳定表达，表达产物能明显促进HUECV304细胞生长。结论：基因转染的MC3T3-E1细胞能稳定、高效表达具有生物学活性的VEGF165和VEGF121重组蛋白。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性.将真核表达质粒pCD-hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线.结果发现VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖.提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因.     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

孕早期外周血VEGF165b降低对预测子痫前期的作用研究

目的:分析血管内皮生长因子165b(VEGF165b)在子痫前期(PE)患者血清中的表达,探讨孕早期外周血VEGF165b作为预测PE发生的生物学指标的临床意义。方法:酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争性酶免疫分析(cEIA)分别检测47例PE患者和42例无高血压正常孕妇、40例未怀孕正常妇女血清中VEGF165b、VEGF的含量。ROC曲线分析孕12周VEGF165b预测PE发生的灵敏度。结果:孕12周,正常孕妇组血清VEGF165b含量[(4.49±1.57)ng.ml-1]与未怀孕组[(0.42±0.18)ng.ml-1]相比显著升高(P<0.01),发展成PE患者的外周血VEGF165b含量[(1.19±0.50)ng.ml-1]与正常孕妇组相比显著降低(P<0.01);ROC曲线显示孕12周VEGF165b预测PE发生具有较高的灵敏度(89.8%)。结论:孕早期母体外周血VEGF165b显著降低可预测PE发生。     

血管内皮生长因子165b对人肝癌HepG2细胞生物学特性的影响

目的：探讨血管内皮生长因子165b（VEGF165b）对人肝癌HepG₂细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法：HepG₂细胞分为空白组（仅加转染试剂）、对照组（转染阴性对照PcDNA3.0表达载体）和PcDNA-VEGF165b组（转染VEGF165b表达载体PcDNA-VEGF165b）。MTT法检测各组HepG₂细胞生存率,RT-PCR法和Western blotting法检测HepG₂细胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室法检测HepG₂细胞迁移能力。结果：与空白组比较,对照组HepG₂细胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。与空白组比较,PcDNA-VEGF165b组细胞中VEGF165b mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,VEGF165 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。空白组和对照组细胞生存率比较差异无统计学意义（P>0.05）;与空白组和对照组比较,PcDNA-VEGF165b组细胞生存率有所降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。细胞迁移实验,空白组和对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义（P<0.05）;与空白组和对照组比较,PcDNA-VEGF165b组HepG₂细胞迁移率明显降低（P<0.05）。结论：VEGF 165b能抑制VEGF165基因和蛋白的表达,VEGF165b对肝癌细胞增殖无明显影响,但可降低肝癌细胞的迁移能力。     

反义VEGF165真核载体的构建

以质粒pcDNA3.1为载体，将血管内皮基因（VEGF）165cDNA片段反向插入得到反义VEGF165真核表达载体，经过酶切电泳和基因测序证实获得的载体插入方向正确，可以进一步用于反义基因表达的实验研究。     

血管内皮生长因子165b抑制肿瘤血管生成的研究进展

研究认为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因差异剪接后能够产生促进血管生成的VEGFxxx和抑制血管生成的VEGFxxxb。在VEGFxxxb家族中,VEGF165b在功能上具有代表性地位,表现出明显的抑制VEGF165所介导的血管生成作用。由于VEGF165b具有机体自然产生、不具有免疫原性的优势,有望通过强制高表达、外源性给予重组蛋白或促进VEGF外显子8b选择性剪接抑制肿瘤血管生成,从而用于肿瘤的治疗。     

Transplantation of VEGF165-gene-transfected endothelial progenitor cells in the treatment of chronic venous thrombosis in rats

Background The organization and recanalization of thrombi is a dynamic and complex process. The aim of this research was to study the cotherapeutic effect of stem cell transplantation and gene transfection on chronic venous thrombosis. Methods We constructed a recombinant adenoviral vector carrying the vascular endothelial growth factor 165 （VEGF165） gene by using the pAdEasy system, which was subsequently identified and amplified. Simultaneously, endothelial progenitor cells （EPCs） were isolated from rat bone marrow using Ficoll, cultured in EBM-2MV medium, and identified. Then, the cells were transfected with the recombinant Ad-VEGF165. The EPCs were labeled with 1 ,1＇-dioctadecyl-3,3,3＇,3＇-tetramethylindocarbocyanine （Dil） before transplantation. A rat model of chronic vein thrombosis was developed by partial ligation of the inferior vena cava. The rats were randomly divided into 4 groups （n=25, each）： A, Ad-VEGF165/EPC-transplantation group received 1 ml （10^6） of Ad-VEGF165/EPCs; B, EPC-transplantation group received 1 ml （10^6） of EPCs; C, Ad/EPC-transplantation group received 1 ml （10^6） of Ad/EPCs; D, control group received 1 ml of the transplantation medium. The thrombi and adjacent caval walls were harvested 28 days after transplantation; real-time quantitative polymerase chain reaction was used to detect the expression level of vascular endothelial growth factor （VEGF） mRNA; and western blotting was used to measure changes in VEGF protein expression. Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining were performed to detect recanalization. Neovascularization was detected by immunohistochemical staining using the antibody for von Willebrand factor （vWF）, which is a component of endothelial cells.The capillary density was quantitatively determined by counting the capillaries under a high-power microscope. Results The Ad-VEGF165 was constructed, and bone-marrow-derived EPCs were cultivated and successfully identified. We determined the optimum transfection ratio that promoted the growth of EPCs. After transfection, the EPCs secreted the VEGF protein. After transplantation, the in vivo survival of EPCs and their differentiation into endothelial cells were determined by detecting the fluorescence associated with the Dil stain. VEGF mRNA was expressed in groups A, B, C and D after transplantation, and the VEGF mRNA level in group A was significantly higher than those in groups B, C and D （P〈0.05）; the VEGF mRNA levels in groups B and C were significantly higher than those in group D （P〈0.05）, and there was no statistical significance between the VEGF mRNA levels in groups B and C. The recanalization capillary density in group A was significantly higher than those in groups B, C （P 〈0.05） and D （P 〈0.01）; the recanalization capillary densities in groups B and C were significantly higher than that in group D （P 〈0.05）. Moreover, there was no statistical significant difference between the values for groups B and C. Conclusions The EPCs were successfully transfected by Ad-VEGF165. A suitable transfection ratio can improve the efficiency of EPCs and the possibility of promotion of angiogenesis after transplantation. Transfected EPCs caused accelerated organization and recanalization of vein thrombi.     

移植过表达人VEGF165的BMSCs促进放疗损伤大鼠模型的组织修复

背景 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的多向分化潜能在组织再生的研究应用中显示出了极大的潜力,同时血管内皮生长因子165（VEGF165）能够促进血管的生成从而促进组织的再生。本研究用VEGF165基因修饰BMSCs移植的方法来恢复放疗大鼠损伤模型的组织修复能力。 方法 从大鼠胫骨分离获取BMSCs;用脂质体将hVEGF165转染至BMSCs;以60Coγ射线照射大鼠右后肢,总吸收剂量为30 Gy,总共40只,照射结束后第1天,将实验分为四组（n=10）：不注射组作为未治疗对照组（组1）,空转染BMSCs组（组2）、未转染BMSCs组（组3）及hVEGF165-BMSCs组（组4）,分别注射照射区组织,共治疗2次,间隔2周。治疗结束1周后行血管造影及血管染色体视学图像分析,对后肢肌肉标本行血管、肌肉显微结构观察、RT-PCR、Western Bloting及免疫组化染色。 结果 结果表明分离得到的BMSCs具有多向分化能力;转染后的BMSCs高表达hVEGF165基因和蛋白;组2、3、4的血管数量、密度、平均管径、平均截面积各项指标及MyoD、myogenin、α-SMA蛋白、CD31蛋白表达均高于组1。hVEGF165mRNA及蛋白的表达及上述指标在注射hVEGF165转染的BMSCs（组4）均高于组2和组3。 结论 过表达VEGF165基因的BMSCs通过促进血管新生和肌纤维的再生有效地增强了组织的修复能力,过表达VEGF165基因的BMSCs具有潜在的临床应用价值。     

米非司酮治疗后VEGF-165在异位和在位子宫内膜中的表达

目的探讨米非司酮对VEGF-165在子宫腺肌症中表达的影响。方法43例子宫腺肌症患者分为对照组(n=21)和米非司酮治疗组(n=22),采用放射免疫法测定对照组(月经第3天)和米非司酮组(术前)血清中FSH、LH、E2、PRL、P及T的水平。采用免疫组化法测定两组患者在在位和异位子宫内膜中的VEGF-165蛋白水平。结果米非司酮组较对照组血清FSH、LH、E2、P明显降低(P<0.05),而血清PRL和T的水平两组间无统计学差异(P>0.05)。VEGF-165在子宫内膜腺上皮细胞内的表达,异位内膜均明显高于在位内膜(P<0.05);而其在间质细胞内的表达,异位内膜与在位内膜无统计学差异(P>0.05)。米非司酮组异位和在位内膜腺上皮细胞、间质细胞中VEGF-165的表达水平均较对照组明显降低(P<0.05)。VEGF-165在对照组异位内膜腺上皮细胞中的表达,增殖期高于分泌期(P<0.05)。结论米非司酮治疗后,VEGF-165在异位和在位内膜中的表达明显下降,可能是通过抑制VEGF蛋白合成,降低血管通透性,抑制新生血管生成,从而有效地控制子宫内膜异位症的发生发展。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …