甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体的敲除及其对杀虫剂敏感性的影响

【目的】本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,探索甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channels, GluCls)基因不同转录变异体编码的SeGluCls对杀虫剂敏感性是否存在差异。【方法】采用RT-PCR和RACE技术获得甜菜夜蛾SeGluCl的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除SeGluCl两个剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b,并构建甜菜夜蛾敲除品系(3a-KO和3b-KO),生物测定甜菜夜蛾敏感品系WH-S(对照品系)及3a-KO和3b-KO品系的3龄幼虫对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈3种杀虫剂敏感性的差异。【结果】获得了甜菜夜蛾SeGluCl全长cDNA序列,并发现其2种剪接变异体(SeGluCl 3a和SeGluCl 3b),SeGluCl 3a(GenBank登录号：OM304353)的开放阅读框(open reading frame, ORF)长1 362 bp,编码454个氨基酸,SeGluCl 3b(Gen...     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

CRISPR/Cas9技术在斑马鱼基因修饰中的应用

CRISPR/Cas9系统的应用促进了基因编辑技术的快速发展,现已成功地在不同模式生物中实现了高效的基因修饰,包括DNA序列的点突变、大片段删除以及外源基因的定向插入等。现就CRISPR/Cas9系统在斑马鱼模式动物中建立基因敲除和敲入品系的最新研究进展作一综述。     

针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。     

利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种＂基因剪刀＂或＂基因武器＂,是细菌重要的＂免疫系统＂。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

基于双元转基因CRISPR/Cas9系统的家蚕pax3基因功能分析

【目的】 本研究旨在以家蚕Bombyx mori为研究模型探索pax3基因在鳞翅目昆虫中的生物学功能。【方法】利用PCR扩增验证家蚕Bmpax3外显子序列;利用qRT-PCR检测Bmpax3在5龄第3天家蚕幼虫头、表皮、脂肪体、中肠、马氏管、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺和生殖腺(包括精巢和卵巢)中的表达谱;利用双元转基因CRISPR/Cas9系统构建Bmpax3敲除突变体,分析Bmpax3突变对家蚕幼虫存活、体节分化及性别差异的影响。【结果】Bmpax3在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠和丝腺中均有表达,其中在前部丝腺表达量最高。Bmpax3突变体的卵孵化率约为90%,但约有80%的突变体在1龄幼虫期死亡,有将近10%的突变个体能幸存并发育到成虫阶段,并且存活成虫数存在性别差异,雄性显著多于雌性。在幸存的成虫中,约有将近1/2的个体腹部末端体节分节异常,表皮条纹混乱,腹节腹板部分缺失,生殖器官及其周围的其他辅助器官出现发育缺陷。【结论】Bmpax3发生突变后会对家蚕的生存及形态发育产生较大的影响,提示Bmpax3可能参与了家蚕的生长发育过程。     

烟草甲clip丝氨酸蛋白酶基因的克隆及其对外源激素和免疫胁迫的表达响应(英文)

【目的】作为细胞外信号级联通路的重要组成部分,含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases, CLIPs)在昆虫发育和先天免疫过程中起着重要作用。本研究旨在克隆烟草甲Lasioderma serricorne CLIP基因,解析其在烟草甲不同发育阶段和幼虫不同组织中的表达模式,分析其在外源激素20-羟基蜕皮酮(20E)和免疫胁迫后的表达特征,为进一步研究其生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆获得烟草甲两个CLIPs基因(LsCLIP1和LsCLIP2)全长cDNA序列,并利用生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和特征,利用MEGA 6.06构建昆虫CLIPs系统发育树;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)研究这两个基因在不同发育阶段［低龄幼虫(卵孵化后24 h内)、高龄幼虫(4龄以上)、蛹(化蛹后48 h以上)、早期成虫(化蛹后24 h内)和晚期成虫(化蛹后7 d)］、5龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、肠道和剩余组织)中以及注射20E(120 ng/幼虫)和来源于大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖(0.2 μL)后4龄幼虫中的表达模式。【结果】克隆获得烟草甲LsCLIP1和LsCLIP2基因的cDNA全序列,其开放阅读框长度均为1 194 bp,编码397个氨基酸。序列分析显示,其氨基酸序列各自具有一个clip结构域和胰蛋白酶结构域。系统发育分析表明,CLIP1和CLIP2都属于subfamily C CLIPs。qPCR结果表明,LsCLIP1和LsCLIP2基因在所检测的各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,分别尤以蛹期和表皮中表达量最高;经20E和肽聚糖诱导后,烟草甲幼虫体内LsCLIP1和LsCLIP2基因的表达量明显提高。【结论】推测LsCLIP1和LsCLIP2可能参与了烟草甲的蜕皮发育和对免疫胁迫的应激响应。本研究将为后续研究昆虫CLIPs的分子调控提供参考。     

家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G_0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G_1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G_1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。     

Construction of a One-Vector Multiplex CRISPR/Cas9 Editing System to Inhibit Nucleopolyhedrovirus Replication in Silkworms

Recently the developed single guide(sg)RNA-guided clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 9 nuclease(CRISPR/Cas9) technology has opened a new avenue for antiviral therapy. The CRISPR/Cas9 system uniquely allows targeting of multiple genome sites simultaneously. However, there are relatively few applications of CRISPR/Cas9 multigene editing to target insect viruses. To address the need for sustained delivery of a multiplex CRISPR/Cas9-based genome-editing vehicle against insect viruses, we developed a one-vector(pSL1180-Cas9-U6-sgRNA) system that expresses multiple sgRNA and Cas9 protein to excise Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV) in insect cells.We screened the immediate-early-1 gene(ie-1), the major envelope glycoprotein gene(gp64), and the late expression factor gene(lef-11), and identified multiple sgRNA editing sites through flow cytometry and viral DNA replication analysis. In addition, we constructed a multiplex editing vector(PSL1180-Cas9-sgIE1-sgLEF11-sgGP64, sgMultiple) to efficiently regulate multiplex gene-editing and inhibit BmNPV replication after viral infection. This is the first report of the application of a multiplex CRISPR/Cas9 system to inhibit insect virus replication. This multiplex system can significantly enhance the potential of CRISPR/Cas9-based multiplex genome engineering in insect virus.     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

The CRISPR/Cas9 revolution continues: From base editing to prime editing in plant science

The ability to precisely inactivate or modify genes in model organisms helps us understand the mysteries of life. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9), a revolutionary technology that could generate targeted mutants, has facilitated notable advances in plant science. Genome editing with CRISPR/Cas9 has gained great popularity and enabled several technical breakthroughs. Herein, we briefly introduce the CRISPR/Cas9, with a focus on the latest breakthroughs in precise genome editing(e.g., base editing and prime editing), and we summarize various platforms that developed to increase the editing efficiency, expand the targeting scope, and improve the specificity of base editing in plants. In addition, we emphasize the recent applications of these technologies to plants. Finally, we predict that CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas9-based genome editing will continue to revolutionize plant science and provide technical support for sustainable agricultural development.     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在番茄中的应用现状及展望北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术是一种能够快速对基因组靶位点进行特定DNA修饰的编辑工具。该文对近年来国内外有关CRISPR/Cas9技术在改善番茄农艺性状及提高生物、非生物胁迫抗性方面的研究进展进行综述,并集中讨论了CRISPR/Cas9面临的一些问题,为该基因编辑技术在番茄的种质创新及基因功能研究方面的应用提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在感染性疾病中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9),CRISPR/Cas9〕是一种新兴的基因编辑技术,与以前的三大基因编辑技术——归巢核酸内切酶、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶技术相比,其在靶向特异性、操作简便性、治疗彻底性、应用广泛性等方面具有更大的优势和发展潜力。艾滋病、乙型肝炎、疟疾等感染性疾病的治疗一直是医学上的重大难题,科学家正努力尝试利用CRISPR/Cas9技术解决这些医学难题。本文主要综述了CRISPR/Cas9技术在这些感染性疾病中应用的研究进展。     

利用CRISPR/Cas9双元转基因体系探究家蚕配子生成素结合蛋白基因Bmggnbp2的功能

[目的]配子生成素结合蛋白2(gametogenetin binding protein 2,ggnbp2)在哺乳动物配子发生等生殖相关过程中发挥重要作用.本研究以家蚕Bombyx mori为模型,探究驯化基因ggnbp2的生物学功能,为鳞翅目昆虫中该基因的深入研究提供线索.[方法]在NCBI GenBank数据库通过...     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术, 可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深, 其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理, 总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展, 包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控, 以期为深入开展这一领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。