FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

苦瓜枯萎病菌过氧化氢酶基因FoCat1致病功能分析

 由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momdicae Sun &Huang)引起的苦瓜枯萎病是一种严重影响苦瓜生产的土传维管束病害。本研究利用分割标记的方法构建FoCat1基因的敲除片段,通过PEG介导的原生质体转化方法对FoCat1基因进行敲除,经4对引物验证得到1个阳性转化子ΔFoCat1-3。突变体ΔFoCat1-3在PDA培养基上的菌落大小、菌丝形态、产孢量等生物学特性与野生型相比均无显著性差异,但是其抵抗外源氧胁迫的能力明显减弱,对苦瓜的致病力明显下降。DAB染色结果显示,接种突变体的苦瓜叶片中过氧化氢的含量明显高于接种野生型菌株的苦瓜叶片。研究结果表明,FoCat1可能不参与病菌正常营养生长过程的调控,但是具有清除寄主产生的活性氧,来减弱寄主对病原菌的杀伤作用的功能,从而参与病原菌的致病过程。     

苦瓜枯萎病菌过氧化氢酶基因FoCat1致病功能分析

 由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momdicae Sun &Huang)引起的苦瓜枯萎病是一种严重影响苦瓜生产的土传维管束病害。本研究利用分割标记的方法构建FoCat1基因的敲除片段,通过PEG介导的原生质体转化方法对FoCat1基因进行敲除,经4对引物验证得到1个阳性转化子ΔFoCat1-3。突变体ΔFoCat1-3在PDA培养基上的菌落大小、菌丝形态、产孢量等生物学特性与野生型相比均无显著性差异,但是其抵抗外源氧胁迫的能力明显减弱,对苦瓜的致病力明显下降。DAB染色结果显示,接种突变体的苦瓜叶片中过氧化氢的含量明显高于接种野生型菌株的苦瓜叶片。研究结果表明,FoCat1可能不参与病菌正常营养生长过程的调控,但是具有清除寄主产生的活性氧,来减弱寄主对病原菌的杀伤作用的功能,从而参与病原菌的致病过程。     

哈茨木霉C2H2型转录因子Tha09974功能研究

哈茨木霉Th33菌株能拮抗多种植物病原真菌，具有重要的研究和应用价值。实验室前期研究了哈茨木霉Th33 Gα蛋白基因Thga1的功能，发现Thga1敲除突变株的分生孢子梗和分生孢子量显著减少。对该敲除株和Th33进行转录组测序，发现共有29个转录因子发生显著差异表达。本文选取差异表达量最大的C2H2型转录因子基因Tha09974进行功能研究。构建了Tha09974敲除突变株Δ9974及其回复突变株R9974，对野生菌Th33、Δ9974和R9974分别进行了生长、产孢及拮抗特性检测。结果显示，与野生菌Th33相比，Δ9974的菌落生长速度没有显著差异，菌丝生物量降低了51.5%，产孢量降低了73.6%；Δ9974较野生菌Th33对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.和黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum的生长抑制率分别降低了41.67%和45.15%。R9974和Th33的生长速度、生物量、产孢量及对番茄灰霉病菌的抑制率没有显著差异，对黄瓜枯萎病菌的抑制率低于野生菌Th33，但高于Δ9974。以上结果说明，Tha09974能够正调控Th33的生长、产孢和对病原菌的拮抗能力，并受到Thga1的正调控。本研究为进一步揭示木霉菌的产孢调控机制奠定了基础。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

京津冀设施大棚根际土壤中筛选出的防治根腐病的生防镰孢菌

 由致病性尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)引起的根腐病严重危害果蔬生产,但非致病性镰孢菌可作为潜在的生防菌。为筛选防治根腐病的非致病生防镰孢菌,从京津冀设施大棚采集茄科、葫芦科果蔬78份根际土样中分离2 402株真菌,筛选出对致病性尖孢镰孢菌(F. oxysporum)具有拮抗效果的真菌173株。利用镰孢菌通用引物进行PCR扩增,从中筛选出28株候选镰孢菌;通过镰孢菌发酵液泡根进行安全性测试,筛选出对寄主黄瓜幼苗安全无害的镰孢菌菌株4株(1418、1441、1436和1473)。进一步通过镰孢菌测序通用引物TEF1αF/TEF1αR结合菌落和分生孢子的形态学特征,1418菌株和1441菌株被鉴定为尖孢镰孢菌(F. oxysporum)、1436菌株被鉴定为茄病镰孢菌(F. solani)。盆栽测试发现,除1441菌株外,1418菌株、1436菌株和1473菌株对黄瓜根腐病的防效均在50%以上,其中1418菌株的防效为70%,与杀菌剂咪酰胺的防效相当,具有很好的应用潜力。本研究筛选获得的具有生防潜力的镰孢菌不仅为镰孢菌致病力分化的研究提供了实验材料,也为新型生防产品的研制奠定了基础。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

基于RNA-seq 的香蕉枯萎病菌转录因子FoSwi6敲除突变体的转录组分析

 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)信号通路转录因子 FoSwi6 在调控香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4)的生理特性和致病性方面发挥着重要作用。为解析转录因子 FoSwi6 的转录调控机制,本研究利用RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和突变体ΔFoSwi6的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有 5 728 个,其中上调表达基因有 2 682 个,下调表达基因有 3 046 个。Gene Ontology功能分析表明,差异表达基因主要富集在生物学过程(biological process)中的代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)和单细胞过程(single-organism process),分子功能(molecular function)组分中的催化活性(catalytic activity)和结合(binding)区域。KEGG 显著性富集分析表明,差异表达基因主要富集在核糖体、乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸合成和 2-氧代环戊烷羧酸甲酯代谢通路。差异表达基因的in silico 分析,揭示其中12个基因可能参与调控Foc4的产孢、生长发育、氧化应激反应、细胞壁合成、甾醇合成、氮素吸收、毒素合成和致病性。该研究为阐明香蕉枯萎病菌的致病机理奠定了理论基础。     

金属蛋白酶FocM352在香蕉枯萎病菌热带4号生理小种侵染过程中的功能

香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)严重威胁世界香蕉产业的可持续发展，一些特殊功能的蛋白在其侵染过程中起重要作用。我们分析Foc TR4接种巴西蕉后的转录组数据发现M35金属蛋白酶(metalloprotease 35)同源基因FocM35＿2在病原菌侵染初期受诱导显著上调表达，经同源重组法敲除该基因，突变体致病力显著下降，菌丝生长速率降低，产孢量略微减少，回补突变体则可以恢复其致病力和生长发育；与野生型菌株相比较，突变体对外源氧胁迫、渗透压和细胞膜压力更敏感；在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的瞬时表达结果显示该蛋白定位于质外体，并引起叶片产生超敏反应(HR,hypersensitive response);该蛋白的缺失还能够诱导寄主更高水平几丁质酶的活性。因此，FocM35＿2是促进Foc TR4侵染寄主的的重要致病因子。     

青枯雷尔氏菌无致病力hrpB突变菌株的纯化分离及其异质性研究

获得纯度高的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,是研发青枯病植物疫苗和防治青枯病害的一种新途径。作者以青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91为出发菌株,通过对hrpB基因敲除,获得无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB。高效离子交换色谱分离结果表明:FJAT-91和FJAT-91ΔhrpB色谱峰型不同,主要表现在峰的保留时间上,FJAT-91只有单一色谱峰,保留时间为6 min;FJAT-91ΔhrpB有P_1和P_2 2个色谱峰,保留时间分别为0.6 min和4.5 min。利用高效离子交换色谱对FJAT-91ΔhrpB进行纯化,获得只有P_1峰的高纯度菌株FJAT-91ΔhrpB-P。FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P与其出发菌株FJAT-91的菌落和菌体形态差异明显。致病力测定结果表明:FJAT-91接种4 d番茄植株开始发病,10 d发病率达100%;FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P接种20 d均未发病。防效试验结果表明:纯化后的菌株FJAT-91ΔhrpB-P对番茄青枯病的防效(81.64%)比未纯化FJAT-91ΔhrpB防效(61.04%)提高了33.75%。本研究获得一株高纯度的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB-P具有良好的生防潜力。     

Argonaute1敲除前后尖孢镰刀菌转录组分析比较

 Argonaute蛋白(AGO)介导的沉默复合体在RNA干扰(RNAi)中起着至关重要的作用。为了探究AGO1在尖孢镰刀菌RNAi中的作用机制,本文以粘团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种FOX-A8野生型和其AGO1缺失突变体(FOX-A8-△Ago1)的菌丝和孢子为材料,分别进行了RNA提取、Illumina HiSeq 2000高通量转录组测序、差异表达基因(DEGs)的显著富集分析;选择菌丝和孢子中的DEGs 进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)验证。GO通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中的醇脱氢酶(NADP⁺)、孢子中的CAMK / CAMKL / CHK 1蛋白激酶均显著上调;KEGG通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中与 MAPK信号通路相关的基因、孢子中与PLD信号通路相关的基因均显著下调;另外,相对于野生型菌株,编码AGO2的基因下调,但是下调不显著。qRT-PCR检测DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。     

Argonaute1敲除前后尖孢镰刀菌转录组分析比较

 Argonaute蛋白(AGO)介导的沉默复合体在RNA干扰(RNAi)中起着至关重要的作用。为了探究AGO1在尖孢镰刀菌RNAi中的作用机制,本文以粘团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种FOX-A8野生型和其AGO1缺失突变体(FOX-A8-△Ago1)的菌丝和孢子为材料,分别进行了RNA提取、Illumina HiSeq 2000高通量转录组测序、差异表达基因(DEGs)的显著富集分析;选择菌丝和孢子中的DEGs 进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)验证。GO通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中的醇脱氢酶(NADP⁺)、孢子中的CAMK / CAMKL / CHK 1蛋白激酶均显著上调;KEGG通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中与 MAPK信号通路相关的基因、孢子中与PLD信号通路相关的基因均显著下调;另外,相对于野生型菌株,编码AGO2的基因下调,但是下调不显著。qRT-PCR检测DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。     

抗黄瓜枯萎病丛枝菌根真菌与根围促生细菌组合菌剂的筛选

 丛枝菌根真菌(AMF)和植物根围促生细菌(PGPR)同时接种具有促生防病的作用。本试验旨在评价AMF与PGPR组合菌剂防治黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum )的效果,以获得高效生防菌剂。于温室盆栽条件下将AMF Funneliformis mosseae(Fm)、Glomus intraradices(Gi)和 Glomus versiforme(Gv)与PGPR菌株(PR2-1、PS1-3、PS1-5、PS2-6和PS3-2)不同组合菌剂处理黄瓜(Cucumis sativus, 品种:香翠16号),测定各处理对黄瓜植株生长量、枯萎病防治效果和黄瓜产量的影响。供试AMF+PGPR各组合菌剂处理能不同程度的增加黄瓜根系AMF侵染率和根围细菌的定殖数量、促进黄瓜生长发育和降低枯萎病危害程度。其中,以Fm+PS3-2和 Gv+PS2-6组合菌剂促生和增产效果最好, 以Fm+PS1-5、Fm+PS3-2和Gv+PS2-6组合菌剂防治枯萎病效果最好。综合评价筛选获得高效组合为Fm+PS3-2和Gv+PS2-6。这两个处理可使黄瓜枯萎病病情指数分别下降50.0%和58.4%,防效达到54.5%和63.7%,具有一定的田间应用潜力。