Aβ42及亚单位疫苗诱导小鼠抗体产生及其中和Aβ42的细胞毒性

目的 :探讨Aβ4 2 及其亚单位肽疫苗接种小鼠后特异性抗Aβ4 2抗体的产生情况。方法 :75只 6wk龄雄性BALB/c小鼠 ,随机分为 5组 :即对照组、Aβ4 2 组 ,Aβ3 6 - 42 组、Aβ1- 15 组和FAβ1- 15组。分别用PBS MF59佐剂 ,Aβ4 2 MF59,Aβ36～ 4 2 七聚赖氨酸 (MAP) MF59,Aβ1- 15 MAP MF59,Aβ1- 15 MAP 福氏佐剂 ,免疫BALB/c小鼠 4次。用间接ELISA法 ,检测各组免疫小鼠血清和脑组织匀浆上清液中特异性抗体的滴度。将Aβ42 、Aβ3 6 - 42 和Aβ1- 15 与培养的PC12细胞共同培养 7d ,用MTT比色法检测 3种抗原肽对PC12细胞的毒性。将各组免疫小鼠的血清加入到含 2 0mg/LAβ4 2 的培养基中 ,再与培养的PC12细胞一起培养 7d ,用MTT比色法测定PC12细胞的存活率。结果 :第 2次免疫后 ,各实验组小鼠的免疫血清均有抗Aβ42 抗体产生 ,且抗体滴度随接种次数的增多而增高。同时 ,在脑组织匀浆上清液中也可检测出低滴度的抗Aβ4 2 抗体。Aβ42 可降低PC12细胞的存活率 ;而不同浓度的Aβ3 6 - 42 和Aβ1- 15 则对PC12细胞的存活率无显著影响。将 4组疫苗免疫血清和 2 0mg/LAβ42 同时加入培养基中培养PC12细胞时 ,可显著提高其存活率。结论 :Aβ42 及其亚单位疫苗 (Aβ1- 15 及Aβ36～ 4 2 )结合MF59佐剂免疫B     

阿尔茨海默病人外周血中抗淀粉样蛋白抗体的特性

目的比较AD病人和健康老年人外周血中的抗Aβ抗体特性。方法随机选择AD患者45例和健康老年人51例,①用间接ELISA法测定血清中的抗Aβ抗体滴度,②免疫组织化学ABC法观察AD病人和健康老人血清中的抗Aβ抗体与Tg2576鼠脑内老年斑的结合情况;③不同抗体水平的AD病人和健康老人的血清分别与PC12细胞培养,用MTT法检测PC12细胞的存活率。结果①AD病人和健康老人血清中的抗Aβ抗体分别为(119.78±84.50)μg/ml和(200.44±216.78)μg/ml,差异有显著性意义(P<0.05);②免疫组化发现用AD病人血清作一抗,抗Aβ抗体不能很好地显示已经形成的老年斑;③虽然AD病人血清中抗Aβ抗体较高,对PC12细胞的保护作用反而下降,且与Aβ42的剂量无相关性;而健康老人的血清仍能表现出较强的PC12细胞保护作用。结论AD病人血清中抗Aβ抗体滴度下降,与老年斑结合能力和对细胞的保护能力也下降。     

接种Aβ42全肽疫苗恒河猴的特异性体液免疫应答

目的 观察恒河猴接种Aβ42肽疫苗后的特异性抗体的产生. 方法 将5只雄性恒河猴分别在0、 2、 6、 10、 14、 18、 22 wk肌内注射Aβ42肽疫苗; 用ELISA法检测恒河猴血清抗Aβ42抗体水平及IgG亚类; 用Western blot检测血清抗Aβ42抗体的特异性; 免疫组化染色法观察抗血清对Tg2576转基因小鼠脑组织中Aβ斑的识别. 结果 疫苗接种后第8周, 恒河猴血清中出现明显的抗Aβ42抗体, 抗体水平随着接种次数的增加而升高, 第24周达1∶ 4 320, 以后抗体水平开始下降.产生的抗Aβ42抗体以IgG1和IgG2为主(IgG2/IgG1>1).血清抗Aβ42抗体具有高度特异性, 可识别Tg2576转基因小鼠脑组织中的Aβ斑. 结论 Aβ42肽疫苗可有效地诱导恒河猴产生特异性体液免疫应答.     

雷公藤甲素抑制APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马内Aβ沉积和老年斑形成

目的 研究雷公藤甲素(T10)对APP/PS1双转基因AD模型小鼠(APP/PS1dtg)β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积与老年斑(SP)形成的影响。 方法 取18只45月龄健康雄性APP/PS1dtg, 随机分为3组,分别以T10灌胃：5μg/(kg&#8226;d) (T10 H组)、1μg/(kg&#8226;d) (T10 L组)和等容量的溶媒灌胃（PLC组）,共计45d。45d后取材,左侧半大脑切片,6E10免疫组织化学方法染色和刚果红染色结合无偏性体视学定量分析,研究T10对海马Aβ沉积和SP形成的影响;分离右侧半海马,免疫印迹法分析海马Aβ蛋白水平的变化。 结果 与PLC组比较, T10 H组海马6E10阳性的Aβ沉积总面积减少了35％(P<0.001),SP总面积减少了32％(P<0.001); T10 L组海马Aβ斑总面积减少了18％(P<0.05), SP总面积减了21％(P<0.05); T10呈剂量依赖性抑制Aβ在APP/PS1dtg 海马的沉积和SP的形成,减少海马内Aβ蛋白水平; 免疫印迹分析也显示,T10 H组海马Aβ蛋白水平最低,PLC组Aβ蛋白水平最高,T10 L组Aβ蛋白水平介于两者之间。     

阿尔茨海默病转基因小鼠不同脑区老年斑的观测

目的:观测阿尔茨海默病转基因小鼠不同脑区,比较改良Bielshowsky镀银染色法与免疫组织化学染色法检测老年斑的可靠性。方法:应用体视学方法分别对改良Bielshowsky镀银染色与Aβ免疫组织化学染色结果计数,统计分析两者相关性。结果:Aβ免疫组织化学染色与改良Bielshowsky镀银染色均可检测到AD转基因小鼠不同脑区的老年斑,阳性物计数结果呈正相关性(r=0.228,P0.01);Aβ免疫组织化学染色法可观察胞质内Aβ的分布。结论:老年斑在AD转基因小鼠不同脑区的分布有差异,改良Bielshowsky镀银染色法与Aβ免疫组织化学染色法均可作为阿尔茨海默病病理特征老年斑的检测手段。     

阿尔茨海默病与β-淀粉样蛋白相关性研究现状

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统变性病,常伴随有认知障碍、记忆力减退、人格改变等。AD的病因和发病机制尚不明确,由β淀粉样蛋白沉积(amyloid-β,Aβ)所积聚的细胞外老年斑(SP),tau蛋白过度磷酸化产生的神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)和神经元丢失伴胶质细胞增生是AD发生的病理学基础。本文综述归纳了AD与Aβ相关性的最新进展情况。     

Aβ亚单位疫苗接种Tg2576鼠对脑内淀粉样斑块沉积和行为学的影响

目的探讨Aβ亚单位疫苗接种对Tg2576鼠淀粉样斑块沉积和行为学损害的影响。方法24只Tg2576鼠随机分为Aβ1-15组、Aβ36-42组、Aβ42组和对照组,9月龄时开始分别接种相应的疫苗,间接ELISA法检测血清和脑匀浆上清液特异性抗体的滴度;免疫组织化学染色观察脑内淀粉样斑块沉积;Morris水迷宫测试行为学变化;组织染色观察脑、肝、脾、肺和肾的组织学变化。结果第2次接种后各实验组即明显有抗Aβ42抗体产生,抗体滴度随接种次数的增加而增加。停止接种,抗体滴度下降。脑匀浆上清液中也检测出低滴度的抗Aβ42抗体;疫苗接种6个月后,Aβ42、Aβ1-15和Aβ36-42组鼠皮层和海马淀粉样斑块沉积量与对照组相比均明显减少（P〈0．01）,其认知能力显著高于对照组（P〈0．01）。Aβ1-15组和Aβ42组相比差异无显著性（P〉0．05）,但优于Aβ36-42组（P〈0．01）;各组鼠的脑、肝、脾、肺和肾均未发现病理变化。结论邯亚单位疫苗接种能有效阻抑Tg2576鼠淀粉样斑块形成和认知功能退化,未发现不良反应。提示用Aβ1-15疫苗替代其全肽疫苗而用于AD免疫治疗,值得进一步研究。     

β-淀粉样蛋白对衰老模型大鼠脑海马神经元的毒害作用

研究β－淀粉样蛋白（β－AP）对衰老大鼠海马神经元的影响。采用D－半乳糖（D－gal)建立衰老动物模型，海马内微注射β－AP，检测各组大鼠Y－迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化，并测定海马超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA)含量，Na^ -K^ -ATP酶活性和海马线粒体膜流动性。可见β－AP加上D－gal组大鼠学习记忆能力，与只用β－AP或D－gal组比较有显著性差异；与β－AP或D－gal组比较Na^ -K^ -ATP酶活性显著降低，MDA含量显著增加，海马线粒体膜流动性显著降低。结果表明，β－AP与D－gal联合使用可导致衰老大鼠脑海马自由基损伤加重，学习记忆能力显著减弱。     

β-淀粉样多肽1-42(Aβ42)多克隆抗体的制备及其鉴定

目的：β—淀粉样多肽1—42(Amyloid β1-42，简称Aβ42)是存在于阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)患者脑组织中的特异病理改变之物，同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。我们制备Aβ42多克隆抗体及其建立测定方法，是希望找到—个特异性鉴定AD的生物指标。方法：将Aβ42多肽与匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫新西兰白兔从而产生抗—Aβ啦多克隆抗体。此特异性抗体可用于ELISA、Western印迹法和免疫组织化学的方法中，并可测定AD脑组织中的特异性淀粉样沉淀物。结果：通过免疫组织化学法鉴定此抗—Aβ42多克隆抗体，结果显示在AD患者的脑组织淀粉样沉淀物中呈阳性。同时应用Western印迹法对Aβ42抗体进行了鉴定，结果显示Aβ42多肽的分子量与Aβ42多肽标准的4．5kDa分子量相一致。结论：我们所制备的Aβ42多克隆抗体能与Aβ42抗原呈特异性结合，这就为研究淀粉样前体蛋白(APP)在生理学和病理生理学上的机制提供了—个有效工具。     

Aβ1-15疫苗免疫接种成年恒河猴的体液免疫效应

目的：观察Aβ1-15疫苗免疫接种成年恒河猴的特异性体液免疫应答。方法： 5只雄性成年恒河猴分别在0、2、6、10、14、18、22周肌肉注射法接种Aβ1-15疫苗；ELISA法检测恒河猴血清抗Aβ1-42抗体及其IgG亚型的水平；Western blot法检测血清Aβ1-42抗体的特异性；免疫组化方法观察抗血清与Tg2576转基因鼠脑Aβ斑的识别。结果： 疫苗接种后第8周，恒河猴血清中出现明显的抗Aβ1-42抗体，抗体滴度随接种次数的增加而升高，第24周达1∶3 840，疫苗停止接种后抗体水平开始下降；血清抗Aβ1-42IgG以IgG1为主；血清Aβ1-42抗体具有高度特异性；抗血清可识别结合Tg2576转基因鼠脑组织的Aβ斑。结论： Aβ1-15疫苗可有效诱导成年恒河猴产生特异性体液免疫应答。     

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础     

Aβ1-42诱导的AD小鼠模型学习记忆能力的变化

目的研究不同剂量β淀粉样蛋白1-42片段(Aβ1-42)诱导的阿尔茨海默病(AD)小鼠模型的学习记忆功能的变化。方法在C57BL/6J小鼠双侧海马注射不同浓度的Aβ1-42各1μL诱导AD模型,并在对照组注射等量溶剂(生理盐水)。注射7天后,应用水迷宫(MWM)对小鼠进行学习和记忆功能的测定。结果与对照组相比,低剂量Aβ1-42(1μg/μL)处理对小鼠学习记忆功能未产生显著影响;而高剂量Aβ1-42(5μg/μL)处理组与对照组比较,潜伏期明显延长(0.05)、周边活动时间百分比增加(0.05)、平台象限活动时间百分比减少(0.05)、平台穿越次数减少(0.05)。结论双侧海马注射5μg(5μg/μL,1μL)的Aβ1-42能够显著地影响小鼠的学习和记忆功能,是制备小鼠AD模型的有效方法。     

锌转运体ZNT1在人阿尔茨海默病大脑的定位

目的研究锌转运体-1(zinc transporter 1,ZNT1)在阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)尸检大脑皮层内的定位分布,探讨ZNT1影响脑锌平衡从而参与AD发病的可能机制。方法应用免疫组织化学、免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜观察ZNT1蛋白和β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)在AD患者大脑内的分布和二者之间的位置关系。结果ZNT1免疫阳性反应产物主要定位于AD大脑皮层老年斑内。几乎所有的Aβ老年斑内均有不同程度ZNT1表达。ZNT1和β-淀粉样蛋白免疫双标结果进一步证实ZNT1免疫产物与Aβ共存于AD患者的老年斑内。结论AD患者大脑皮质Aβ老年斑内有大量ZNT1蛋白表达,提示ZNT1可能参与AD大脑皮质Aβ老年斑的形成。     

C5a及其受体拮抗剂在Aβ1-42处理的BV2细胞TNF-α和CD88表达中的作用

目的 探讨C5a在阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞病变模型中释放炎性因子的作用及其机制,明确C5a受体拮抗剂对上述病变过程的干预作用.方法 制备Aβ1-42寡聚体,用Aβ1-42寡聚体刺激BV-2小胶质细胞建立AD小胶质细胞病变模型.实验组分为Aβ1-42干预组、Aβ1-42+ C5a组、Aβ1-42+ C5aRA组、Aβ1-42+ C5a+ C5aRA组,分别加入不同浓度的C5a、C5aRA、C5a+ C5aRA进行干预,以小胶质细胞无干预组为空白对照.通过流式细胞术测定细胞表面C5a受体(CD88)的表达、ELISA法检测上清液中炎症因子TNF-α的浓度.结果 Aβ1-42刺激小胶质细胞分泌TNF-α,Aβ1-42组TNF-α浓度与空白对照组相比明显增加(P＜0.05),该组CD88表达高于空白对照组(P ＜0.01);Aβ1-42+ C5a组的TNF-α浓度高于单纯Aβ1-42组(P＜0.05),Aβ1-42+ C5aRA组TNF-α浓度低于单纯Aβ1-42组(P＜0.01),而Aβ1-42+ C5a组及Aβ1-42+ C5aRA组的CD88表达与单纯Aβ1-42组相比无显著差异(P＞0.05).结论 C5a能刺激小胶质细胞分泌炎症因子TNF-α,且与Aβ1-42有协同作用,而C5aRA则能有效抑制该通路.     

淀粉样蛋白膜内片段疫苗对APP转基因小鼠的治疗研究

目的依据淀粉样蛋白膜内片段(intramembranous fragments of amyloid-β,IF-Aβ)的膜定位和小分子特点,在体研究IF-Aβ疫苗对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)转基因(transgenic,Tg)小鼠的治疗作用,以期寻找较Aβ42更安全有效的治疗阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)的治疗疫苗。方法分别用PBS、KLH-IF-Aβ(50μg/只)、KLH-IF-Aβ(100μg/只)和KLH-Aβ42(100μg/只)免疫对照组、IF50组、IF100组和Aβ42组6月龄APP Tg C57BL/6J小鼠,共4次2.5月;水迷宫检测APP Tg小鼠认知功能变化;ELISA检测血清抗体和脾细胞释放γ-干扰素;组织学检测模型鼠大脑老年斑的变化;评价免疫APP Tg小鼠大脑淋巴细胞浸润情况。结果免疫4个月后,IF-Aβ疫苗对APP转基因小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性;IF50组小鼠的认知功能加强,大脑皮层区老年斑有所减少,大脑皮层和海马区无明显的淋巴细胞浸润;IF100组小鼠的认知功能下降,大脑皮层老年斑明显减少,大脑皮层和海马区出现明显的淋巴细胞浸润;Aβ42组小鼠认知功能有所提高,大脑皮层老年斑明显减少,大脑皮层和海马区出现淋巴细胞浸润。结论在合适的免疫剂量下,与Aβ42比较,IF-Aβ对APP转基因模型小鼠的治疗更加安全有效,为AD免疫治疗的临床研究开辟了一个新的良好前景。     

Aβ_(42)及GM-CSF双基因重组腺病毒的构建和免疫原性

目的构建含有β-淀粉样蛋白(Aβ42)及核糖体进入位点(IRES)引导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)双表达重组腺病毒疫苗。方法 PCR法扩增带有IgGк轻链信号肽序列的Aβ42基因、IRES基因和小鼠GM-CSF基因,定向克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒Ad-Aβ42-IRES-GMCSF,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(AD-Aβ42)。重组腺病毒经氯化铯密度梯度离心纯化后感染293细胞及Hela细胞,用免疫细胞化学和ELISA方法分别检测Aβ42及GM-CSF在细胞内和培养液中的分泌表达。免疫动物鉴定其免疫原性。结果 pAdTrack-Aβ42-GMCSF测序结果和预期一致,纯化的AD-Aβ42感染Hela细胞后,免疫细胞化学证实Aβ42基因在Hela细胞内表达。AD-Aβ42感染293细胞后,ELISA检测培养上清中Aβ42含量为(159.87±33.26)ng/mL,GM-CSF含量为(205.45±38.20)ng/mL。免疫动物能诱导机体产生高滴度的抗Aβ抗体。结论成功制备了AD-Aβ42,核糖体进入位点(IRES)成功引导的GM-CSF的表达,感染细胞证实其呈分泌表达,接种动物能诱导高滴度抗Aβ抗体。为老年性痴呆(AD)的基因治疗做好铺垫。     

不同表位Aβ亚单位疫苗引起免疫反应类型及疫苗安全性评价

为了研究不同表位Aβ亚单位疫苗接种Tg2576鼠引起的免疫反应类型和疫苗的安全性,本研究选用32只5月龄Tg2576小鼠,并随机分成对照组、Aβ42组、Aβ1-15组和Aβ36-42组,5月龄时开始分别接种相应疫苗,接种7个月,间接ELISA法测定血液及脑匀浆上清液中抗Aβ42的抗体滴度。分别取4组小鼠的脾细胞进行培养,用刀豆蛋白(ConA)和各自抗原刺激,ELISA法检测培养液中IFN-γ,IL-2,IL-4和IL-10的含量,免疫组化法检测脑内小胶质细胞的增生情况,组织化学法检测脑、肝、脾、肺、肾组织有无病理性改变。结果显示:(1)与对照组相比,疫苗免疫组血清和脑组织匀浆上清液中抗Aβ42抗体的滴度明显有所增高(P<0.01);(2)脾细胞培养,经ConA或各自抗原刺激后,3组疫苗免疫组细胞增殖显著高于对照组(P<0.01)。培养液中免疫因子检测显示Aβ42组IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10均较高,Aβ1-15组中IL-4和IL-10较高,Aβ36-42组IFN-γ和IL-2较高。免疫组织化学法显示4组小鼠大脑皮质与海马部位均有大量OX-42阳性小胶质细胞,疫苗免疫组OX-42细胞数量更多,但4组之间无显著性差异(P>0.05);(3)HE及组织特异性染色显示在疫苗接种组鼠的重要器官未见病理性改变。上述结果表明,Aβ42疫苗可引起Th2和Th1免疫反应,Aβ1-15亚单位主要引起Th2免疫反应,Aβ36-42疫苗主要引起Th1免疫反应。3种疫苗均可进一步激活脑内小胶质细胞,增强其Aβ清除能力,未发现疫苗接种引起的毒副作用。因此,本实验结果提示Aβ1-15亚单位疫苗更符合AD免疫治疗的要求。     

利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体

目的抗Aβ神经毒性的Aβ靶向肽噬菌体的筛选。方法分别合成Aβ1-10序列组成的短肽并将其生物素化;以生物素化Aβ1-10为靶分子,用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力的噬菌体;采用生物传感分析技术,通过结合特异性实验和短肽竞争性抑制实验,检测所筛选的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关系。结果经过对靶分子Aβ1-10的3轮筛选,筛出了与Aβ1-10特异性结合的单克隆噬菌体;生物传感分析技术结果进一步表明,靶分子（Aβ1-10）与所筛选噬菌体之间的结合具有高度特异性。结论筛选出了展示特异性高亲和力结合Aβ1-10短肽的噬菌体。     

阿尔茨海默病患者外周血Aβ抗体和细胞因子的变化

目的 探讨阿尔茨海默病（AD）患者外周免疫功能的变化。 方法 以2006-06～2007-04广州市老人院29例AD患者作为观察对象,其中轻中度AD患者19例,重度10例;对照组19例为同期健康老人。用夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定外周血Aβ抗体以及抗原特异性细胞因子的水平;流式细胞术(FACS)检测外周血淋巴细胞亚群变化;酶联免疫吸附斑点试验（ELISPOT）检测抗原特异性细胞因子的分泌细胞频数。 结果 轻中度和重度AD组患者外周血Aβ₄₂抗体水平较对照组有不同程度的下降(分别为P<0.05,P<0.01)。AD组CD8较对照组显著升高（P<0.05）; CD4较对照组显著降低（P<0.05）; 轻中度和重度AD组之间CD8、CD4及CD4/ CD8差异均无统计学意义(P>0.05)。AD组外周血单核细胞(PBMC)培养上清IFN-γ的含量较对照组降低（P<0.05）,以重度AD组更明显。ELISPOT检测结果,AD组每4×10⁵个PBMC中分泌IFNγ的细胞频数较对照组显著减少（P<0.01）,以重度AD患者更为明显。 结论 AD患者外周血Aβ抗体水平下降;淋巴细胞亚群失调,特异性细胞免疫功能受损。