放射抗拒人鼻咽癌细胞系的建立及其抗拒机制的初步探讨

[目的]建立放射抗拒人鼻咽癌细胞系模型并观察人鼻咽癌细胞经X射线反复照射后放射敏感性的变化及初步探讨其放射抗拒的机制.[方法]利用X射线对人鼻咽癌细胞HONE-1、SUNE2细胞系进行照射,采用剂量梯度法确定其亚致死照射剂量后,每次照射1次亚致死剂量,共照射5次或以上(HONE-1:6Gy×5次,SUNE2:4Gy×7次).采用克隆形成实验等测定所得的HONE-1-IR,SUNE2-IR细胞系及其亲代细胞HONE-1、SUNE2的放射敏感性、细胞周期特征及SP细胞比例.[结果]与亲代细胞HONE-1,SUNE2相比,HONE-1-IR、SUNE2-IR细胞的D0、Dq及SF2值均增大,HONE-1-IR细胞的放射抗拒性(D0)是HONE-1细胞的1.336倍,SUNE2-IR的D0值为SUNE2的1.094倍,表现出一定的放射抗拒性;HONE-1-IR、SUNE2-IR的S期细胞比例较其亲代细胞HONE-1、SUNE2明显增高(HONE-1-IR ys HONE-1:43.56％vs 23.08％,P=-0.002;SUNE2-IR vs SUNE2:32.64％vs 19.20％,P=0.029),G2/M期细胞比例明显降低(HONE-1-IRvsHONE-1:13.65％vs29.51％,P=0.002;SUNE2-IR vs SUNE2:10.25％vs22.63％,P=0.026),而G0/G1期细胞比例则无明显差异(P=0.735,P=0.572);HONE-1-IR细胞的SP细胞比例较HONE-1细胞明显增高(3.96％vs 0.02％),而SUNE2-IR细胞与SUNE2细胞的SP细胞比例分别为0.27％、0.06％.[结论]人鼻咽癌细胞株HONE-1、SUNE2经亚致死剂量X射线多次照射后而建立的后代细胞HONE-1-IR、SUNE2-IR具有一定的放射抗拒性;HONE-1-IR、SUNE2-IR细胞显示出与亲代细胞不同的细胞周期特征,放射抗拒性也可能与SP细胞比例增高有关,值得进一步探讨.     

放射耐受性结肠癌细胞亚株的建立及其生物学特性

背景与目的：结肠癌是消化系统的常见肿瘤,放疗是其重要的治疗手段之一。诱导并筛选具有放射耐受性的结肠癌细胞亚株,为研究结肠癌放射耐受的机制提供实验模型。方法：应用梯度递增剂量的γ射线对SW620细胞株进行诱导照射,筛选得到放射耐受细胞亚株SW620/R。观察细胞的形态变化和生长情况,通过CCK8法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞照射的周期及凋亡的变化,克隆形成实验检测细胞克隆形成率和放射敏感性。结果：通过照射剂量梯度递增的诱导方法,成功建立了SW620/R细胞亚株。SW620/R细胞亚株形态与亲本细胞明显不同,并且在高剂量射线照射后仍能继续生长;鉴定实验显示SW620/R细胞亚株与亲本细胞相比倍增时间明显延长,克隆形成率显著下降;在细胞周期上S期的比例显著上升,并且在照射后未出现周期的阻滞现象,同时发现其自发凋亡率显著下降;克隆形成实验显示其放射耐受性明显升高。结论：成功建立了放射耐受的细胞亚株SW620/R,经鉴定其放射敏感性显著降低,且两者在增殖、克隆形成率、细胞周期和自发凋亡上差异有统计学意义(P<0.05)。     

X线反复照射人食管鳞癌细胞系KYSE-150的生物效应研究

目的 建立人食管鳞癌放射抗拒性细胞系,并检测肿瘤干细胞标志物的表达,以期了解肿瘤干细胞与放射抗拒性形成之间的关系.方法 分次照射建立人食管鳞癌放射抗拒性细胞系KYSE-150R,在相差显微镜下观察细胞形态学差异,用G显带法进行染色体分析.用成克隆实验验证KYSE-150和KYSE-150R细胞的放射敏感性差异,流式细胞术检测它们的细胞周期分布,Western Blotting法检测它们中肿瘤干细胞(CSCs)标志物β-catenin和Integrin-β_1的表达.结果 KYSE-150R细胞的群体倍增时间长于亲代细胞KYSE-150[(25.90±0.55)h:(23.62±0.23)h,t=6.62,P=0.00].KYSE-150R细胞的染色体数目增加,并观察到染色体畸变.KYSE-150R细胞SF_2、D_0、D_q及N值均高于KYSE-150细胞,Dn值比为1.21.流式细胞仪分析显示KYSE-150细胞照射后S期比例增加(45.35%±4.03%:55.09%±1.70%,t=-3.86,P=0.02),G_2+M期比例下降(9.91%±3.83%:1.15%±0.32%,t=3.95,P=0.02),而KYSE-150R则变化不大.Western Blotting结果 显示KYSE-150R中的β-catenin和Integin-β_1的表达量约为KYSE-150细胞的2倍.结论 新细胞系KYSE-150B比其亲本更具放射抗拒性,其含有的CSCs比例也较其亲本高,证明CSCs与放射抗拒性产生机制有关.     

番茄红素体外对人食管癌细胞SHEEC36的初探

目的：探讨番茄红素对体外培养的人禽管癌细胞的影响,方法：应用MTT法和流式细胞术手段,观察不同剂量的番茄红素对体外培养的人胚食管上皮癌细胞汕头株36代（SHEEC36）的增殖抑制及诱导凋亡作用。结果：MTT实验显示,番茄红素体外对SHEEC36细胞增殖有明显的抑制作用。结论：翻茄红素体外能抑制SHEEC36增殖,发挥抗肿瘤作用的机制可能与阻断S期以及诱导细胞凋亡有关。     

低氧下三氧化二砷对食管癌Eca109细胞放射敏感性的影响

目的： 观察三氧化二砷（As 2O 3）在低氧条件下对食管癌Eca109细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨其发挥放射增敏作用的可能机制。 方法： CoCl 2处理模拟肿瘤细胞模拟低氧微环境,MTT法分别检测常氧和低氧条件下不同浓度As2O3及不同剂量放射线对食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测低氧下As 2O 3、放射线单独及两者联合对细胞周期及凋亡的影响,Western blotting检测经As 2O 3、放射线单独及两者联合作用后Eca109细胞中HIF-1α、p27蛋白的表达情况。 结果： 在常氧和低氧两种条件下,As2O3均呈时间和剂量依赖方式抑制Eca109细胞增殖,相同时间和相同剂量条件下,其抑制水平相当（P>0.05）;而低氧下放射线对Eca109细胞增殖的抑制作用较常氧下明显减弱（P<0.05）。低氧下Eca109细胞周期出现G 0/G 1期阻滞、G 2/M期细胞比例明显减少（P<0.05）,As 2O 3在低氧条件下可诱导G 2/M期阻滞、G 0/G 1期细胞比例减少。As 2O 3与放射线联合作用时,Eca109细胞的凋亡率大于两者单独作用之和。低氧条件下,Eca109细胞HIF-1α、p27蛋白表达均明显增强,As 2O 3可逆转HIF-1α、p27表达水平的升高。 结论： 低氧条件下,As 2O 3对食管癌Eca109细胞有放射增敏作用,其机制可能与下调HIF-1α进而降低p27表达水平、解除G 0/G 1期细胞周期阻滞和促进细胞凋亡有关。     

线粒体DNA影响细胞的放射敏感性

目的 了解细胞接受辐射后,线粒体DNA（mdDNA）对细胞放射敏感性的影响。方法 利用缺乏mtDNA的细胞株（ρ^0细胞）、携带变异mtDNA的细胞株（syn^-细胞）和携带正常mtDNA的细胞株（ρ^0细胞）进行体外实验研究。3种细胞株经不同剂量伽玛射线照射后,采用集落形成实验和流式细胞术等方法,获得3种细胞株的存活曲线（应用LQ模型）,并分析其细胞周期的变化和比较各种细胞之间凋亡的差异。结果 3种细胞株的存活曲线表明,ρ^0细胞株比其它2种细胞株显示对射线有较强的抵抗（F=10.45,P=0.022)。2、5和8Gy照射之后,ρ^0细胞株的细胞凋亡明显少于其它2种细胞株（F=14.29,P=0.0007;F=4.80,P=0.0293;F=4.98,P=0.0154）。3种细胞株被照射后细胞周期的变化不明显。结论 mtDNA可能是影响细胞放射敏感性的一个重要因素。     

人脑胶质瘤细胞株MGR2放射抗拒性的诱导

背景与目的:放射治疗是脑胶质瘤重要辅助治疗手段之一,但脑胶质瘤放射敏感性存在很大差异。本研究通过对放射相对敏感的人脑胶质瘤细胞株进行放射诱导得到具有稳定放射抗拒性的后代细胞,从而为研究胶质瘤放射抗拒机制提供具有可比性的成对细胞。方法:选取对X射线相对敏感的人脑胶质瘤细胞株MGR2[2Gy照射下的存活分数(survivalfractionof2Gy,SF2)为0.180±0.05]进行间歇性大剂量X射线照射(每次2Gy,共3次,而后每次5Gy,共2次),每次照射后的细胞继续培养,待5～8周存活的细胞状态稳定后进行下一次照射,整个照射及培养过程历时11个月,最终得到的后代细胞命名为MGR2R(MGR2radiationinduction)。采用MTT法检测MGR2和MGR2R细胞生长的倍增时间,平板集落形成法和线性二次模型(L-Q模型)拟合MGR2和MGR2R细胞的存活曲线并计算相关放射生物学参数和SF2值。血清饥饿细胞周期同步化方法检测MGR2和MGR2R的细胞周期变化。结果:MGR2的倍增时间为3.6天,MGR2R的生长速度减慢,倍增时间为4.0天。MGR2和MGR2R的α值分别为0.447和0.089(t=4.524,P=0.011),β值分别为0.177和0.141(t=1.562,P=0.193),SF2值为0.208和0.478(t=-6.062,P=0.040),MGR2R的放射抗拒性增加。细胞周期同步化后MGR2的细胞周期分布为G1期54.8%,S期30.9%,G2期14.3%,去同步化后G1期35.9%,S期51.2%,G2期12.8%,MGR2R正常生长时存在G2期阻滞(81.7%),同步化后G1期55.7%,S期27.8%,G2期16.6%,去同步化后分别为G1期56.4%,S期26.7%,G2期16.9%,MGR2R存在G1期阻滞,去同步化后两者细胞周期改变不同。结论:人脑胶质瘤细胞株MGR2经间歇性大剂量X射线多次照射后得到的后代细胞MGR2R具有稳定放射抗拒性。MGR2R生长速度减慢,倍增时间延长,同时存在G1和G2期阻滞,可能与其放射抗拒性的产生有关。     

卡培他滨对食管癌细胞系E09706细胞毒性和放射增敏作用的研究

目的：探讨卡培他滨对食管癌细胞系EC9706细胞毒性和放射增敏作用。方法：取健康成年家兔1只，以卡培他滨141mg／kg，对其进行灌胃，分别于灌胃前、后2．5～3h，取耳缘静脉血8～10mL，不加抗凝剂，并防止溶血和细菌污染，离心取血清－20℃保存备用；用CCK8分别检测不同量的加药血清和对照血清对食管癌细胞系EC9706细胞毒性，同时观察不同量的加药血清对食管癌细胞系EC9706的放射增敏作用。结果：加药血清对食管癌细胞系EC9706细胞有明显的抑制作用，其抑制作用48h达到高峰，2、4、6、8和10μL血清作用细胞48h后抑制率分别为14．29％、23．96％、50．59％、52．16％和53．96％（P均为0．00），72h其细胞毒性无增加；加药血清孵育2．5h后，在相同放射剂量作用下，不同量血清组的OD值均显著低于对照组（P值均为0．00），其增敏作用无明显的剂量依赖性。结论：卡培他滨对食管癌细胞系EC9706有明显的细胞毒性和放射增敏作用。     

卡培他滨对食管癌细胞系EC9706细胞毒性和放射增敏作用的研究

目的:探讨卡培他滨对食管癌细胞系EC9706细胞毒性和放射增敏作用。方法:取健康成年家兔1只,以卡培他滨141mg/kg,对其进行灌胃,分别于灌胃前、后2.5～3h,取耳缘静脉血8～10mL,不加抗凝剂,并防止溶血和细菌污染,离心取血清-20℃保存备用;用CCK8分别检测不同量的加药血清和对照血清对食管癌细胞系EC9706细胞毒性,同时观察不同量的加药血清对食管癌细胞系EC9706的放射增敏作用。结果:加药血清对食管癌细胞系EC9706细胞有明显的抑制作用,其抑制作用48h达到高峰,2、4、6、8和10μL血清作用细胞48h后抑制率分别为14.29%、23.96%、50.59%、52.16%和53.96%(P均为0.00),72h其细胞毒性无增加;加药血清孵育2.5h后,在相同放射剂量作用下,不同量血清组的OD值均显著低于对照组(P值均为0.00),其增敏作用无明显的剂量依赖性。结论:卡培他滨对食管癌细胞系EC9706有明显的细胞毒性和放射增敏作用。     

miRNA在食管癌放射敏感性中作用机制的研究进展

摘 要：食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,放疗是食管癌主要的治疗手段,其疗效具有个体化差异,大量研究发现miRNA与食管癌放疗敏感性密切相关。全文对miRNA调节食管癌放疗敏感性的作用及机制进行概述。     

永生化人食管鳞状上皮细胞系的建立及其染色体不稳定性的研究

[目的]建立永生化人食管鳞状上皮细胞系，并研究细胞永生化过程中以及食管肿瘤细胞染色体的不稳定性。[方法]用人乳头状瘤病毒16型E6／E7（HPV16E6／E7）转染正常人食管鳞状上皮细胞，连续传代培养，检测HPV16E6／E7基因的整合情况及其表达，并对不同代次永生化细胞及食管肿瘤细胞进行端粒荧光原位杂交（FISH）检测和分裂后期细胞形态分析。[结果]HPV16E6／E7基因转染至人食管鳞状上皮细胞后，增殖旺盛，已传至第75代。在细胞危机期（第13和第17代），TTAGGG端粒缺失数为6．0±1．2和4．7±1．5（缺失率分别为6．7％和5.3％）．细胞间桥的出现率为28．0％～30．9％。细胞永生化以后（第47代），端粒缺失数减至2．6±0．7（缺失率3％），细胞间桥出现率降至3．6％，与危机期的比较差异有统计学意义，而与肿瘤细胞的分裂异常相一致。在细胞永生化过程中，细胞间桥的出现率与端粒的缺失率呈正相关性。[结论]HPV16E6／E7基因可以导致人食管鳞状上皮细胞永生化，在此过程中存在较多端粒缺失和细胞间桥，表明染色体的不稳定性在细胞永生化和恶性转变过程中起到重要作用。     

放射抗拒性食管癌细胞株KYSE-150R上皮—间质转化特性鉴定

[目的]鉴定放射抗拒性食管癌细胞株KYSE-150R获得上皮—间质转化(EMT)表型。[方法]食管鳞状细胞癌细胞株KYSE-150经分次反复照射、单克隆培养,筛选出具有放射抗拒性细胞株KYSE-150R。克隆形成实验计算细胞存活率,拟合生存曲线并计算放射生物学参数。高倍显微镜下观察细胞形态学变化。采用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光检测上皮表型标志物E钙黏蛋白(E-cad)、间质表型标志物波形蛋白(VIM)和转录因子Slug、Snail与Twist的表达。[结果]构建的食管癌细胞株KYSE-150R比其亲本对射线更加抗拒,经传代50代后仍保留放射抗拒性。放射抗拒的食管癌细胞株KYSE-150R发生EMT相符的形态学改变:细胞呈纺锤体状,极性消失。与母株相比,KYSE-150R中E-cad表达下降,VIM、Slug及Snail表达上调,Twist表达未见明显变化。免疫荧光染色证实细胞膜E-cad蛋白的丢失,上调的β-catenin移位至细胞核。[结论]放射抗拒的食管癌细胞株KYSE-150R获得了EMT表型,其与食管癌放射抗拒的形成有关。     

抑瘤宁对食管癌细胞系Eca-109作用的研究

目的研究抑瘤宁对食管癌细胞系Eca-109的生长抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测抑瘤宁及其组方中各单药对体外培养Eca-109细胞的生长抑制作用；采用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率。结果抑瘤宁较组方中各单药更能明显的抑制Eca-109细胞的生长，流式细胞仪检测结果显示，各实验组S期细胞百分率明显升高，Go／G1期细胞百分率明显下降（其中各单药组、抑瘤宁组与对照组比较，P〈0．01；各单药组与抑瘤宁组比较，P〈0．01），细胞被阻滞于S期，细胞凋亡率升高。结论抑瘤宁对Eca-109细胞的增殖具有明显抑制作用，其机制可能与细胞周期阻滞和凋亡有关。     

具干细胞特性食管癌耐放射细胞株基因表达分析

[目的]比较具干细胞特性食管癌耐放射细胞株与其亲本基因表达水平的差异。[方法]Agilent 4×44K人全基因组芯片检测具干细胞特性食管癌耐放射细胞株与其亲本细胞,GeneSpring GX 10．0．2数据分析挑选差异表达基因,进一步对差异表达基因进行GO分析和干细胞密切相关的信号通路分析,Real-timePCR验证芯片结果。[结果]两组细胞有明显不同的表达谱,差异表达基因多达2246个（fold change cut-off≥2）。在分子功能中,信号感应激活最高,占75．11％;在生物过程中,细胞进程、生物调节分别占35．94％和25．8％;在细胞组分方面,细胞、胞内区、跨膜区的变化比较显著。ALDH1基因表达发生了改变,其中ALDH1A3最显著。Hedgehog通路,PTCH1下调,而GLI2上调。BMP-TGFβ通路信号转导中．MMP3、MMP9上调．FOXL1、BMP4、TGFB2、TGFB3下调。Notch通路相关信号基因均表现为下调。Wnt通路信号转导变化比较复杂,其中WNT4、WNT8B、DKK2、CTNNB1改变超过2倍。Real-time PCR验证芯片结果可靠．[结论]具干细胞特件的食管痛放射抵抗细朐株与其亲本慕因表达水平有明显差异．     

食管癌分子生物学研究进展

癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。该文就近年来在细胞周期、信号传导、凋亡等过程中的有关基因及新发现的肿瘤相关基因在食管癌发生发展中的作用进行简要阐述。     

红参含药血清对人乳腺癌MCF?鄄7细胞增殖和细胞周期的影响

[目的]研究红参含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和细胞周期的影响.[方法]采用MTT法观察红参含药血清对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖活性.流式细胞术检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞周期、细胞凋亡率.[结果]红参低剂量含药血清对MCF-7细胞有促增殖作用,24、48、72h时增殖率分别为105.9％、115.9％和121.5％.而高剂量对MCF-7细胞表现为抑制作用.红参低剂量组使MCF-7细胞S期DNA含量比例明显增多,高剂量组使细胞周期阻滞在G0/G1期,并能够诱导细胞凋亡,凋亡率达26.86％.[结论]红参含药血清在高剂量时抑制MCF-7细胞生长,低剂量时对细胞具有促增殖作用.     

食管小细胞癌与小细胞肺癌凋亡生物学特性的研究

[目的]探讨原发性食管小细胞癌(primary esophageal small cell carcinoma,PESC)和小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)凋亡生物学特性。[方法]采用免疫组织化学SP法检测survivin,caspase-3,bcl-2,mtp53在PESC和SCLC中的表达。[结果]PESC和SCLC中survivin,caspase-3,bcl-2,mtp534种蛋白的阳性分布无统计学差异(P>0.05)。在PESC和SCLC survivin阴性组中,caspase-3阳性表达率分别为72.41%和62.07%,均明显高于survivin阳性组(30.00%和25.00%,P<0.05)。在这两种小细胞癌中,survivin与caspase-3表达呈负相关;bcl-2与mtp53的表达呈正相关;bcl-2与caspase-3或survivin之间无相关性。[结论]食管小细胞癌和小细胞肺癌的抗凋亡通路存在诸多相同之处,survivin,bcl-2和mtp53均参与了两种小细胞癌的发生发展。     

三氧化二砷对食管癌细胞系EC9706作用的研究

目的探讨不同浓长三氧化二砷（As2O3）对食管癌细胞系EC9706的生长抑制作用及其机理。方法不同浓度三氧化二砷作用于细胞EC9706,采用MTT法检测细胞生长,倒置显微镜观察细胞形态,并通过DNA梯状电泳和流式细胞仪检测凋亡。结果三氧化二砷剂量依赖性抑制细胞生长;观察到典型的细胞凋亡形态学特征性改变;琼脂糖电泳呈现凋亡DNA梯状条带;流式细胞仪分析。细胞株EC9706存在明显的G0／C1期阻滞。结论As2O3具有抑制食管癌细胞株EC9706生长作用,其机理是诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。     

Involvement of Cdc25c in Cell Cycle Alteration of a Radioresistant Lung Cancer Cell Line Established with Fractionated Ionizing Radiation

Cancer patients often suffer from local tumor recurrence after radiation therapy. Cell cycling, an intricatesequence of events which guarantees high genomic fidelity, has been suggested to affect DNA damage responsesand eventual radioresistant characteristics of cancer cells. Here, we established a radioresistant lung cancercell line, A549R , by exposing the parental A549 cells to repeated γ-ray irradiation with a total dose of 60 Gy.The radiosensitivity of A549 and A549R was confirmed using colony formation assays. We then focused onexamination of the cell cycle distribution between A549 and A549R and found that the proportion of cells inthe radioresistant S phase increased, whereas that in the radiosensitive G1 phase decreased. When A549 andA549R cells were exposed to 4 Gy irradiation the total differences in cell cycle redistribution suggested thatG2-M cell cycle arrest plays a predominant role in mediating radioresistance. In order to further explore thepossible mechanisms behind the cell cycle related radioresistance, we examined the expression of Cdc25 proteinswhich orchestrate cell cycle transitions. The results showed that expression of Cdc25c increased accompanied bythe decrease of Cdc25a and we proposed that the quantity of Cdc25c, rather than activated Cdc25c or Cdc25a,determines the radioresistance of cells.