家兔胰岛分离纯化方法的改进

目的介绍一种新的家兔胰岛分离纯化方法并进行纯化后胰岛的外观、活性和胰岛细胞团表面结构等质量分析。方法雄性日本大耳白,采用2 mg/m L胶原酶V逆行胰管灌注和消化,并用Hanks液洗涤,用Histopaque-1119、Histopaque-1077密度梯度离心进行胰岛纯化,DTZ、FD-PI染色鉴定胰岛纯度和活性,扫描电镜观察纯化后胰岛表面结构。结果家兔胰管开口于小肠,纯化得到家兔胰岛外形圆整,纯度90%,活性(87.4±5.9)%,纯化前胰岛当量为(1 874.8±464.5)IEQ,纯化后胰岛当量为(1 254.8±235.8)IEQ;扫描电镜结果显示胰岛细胞团表面有被膜,但部分胰岛被膜被消化。结论采用此方法可快速得到纯度高、活性好且结构完整的家兔胰岛,为进一步进行家兔胰岛体外质量及体内移植研究奠定了基础。     

国产胶原酶在小鼠胰岛分离中的效果研究#br#

目的 研究一种国产胶原酶在小鼠胰岛分离中的分离效果,探索该胶原酶在胰岛分离中应用的 可行性。方法 将国产胶原酶分别配成不同浓度的胶原酶溶液和含中性蛋白酶的胶原酶的溶液,经胰管逆行灌注胶原酶的方法进行小鼠胰岛分离,采用Ficoll液对胰岛进行纯化,计数所得的胰岛细胞团,培养 6 h后检测活性,对最佳分离结果的胰岛做同系糖尿病小鼠的肾被膜下移植,监测术后血糖和进行组织学 检查,以进口Sigma胶原酶V为对照。结果 国产胶原酶在小鼠胰腺消化时间、所得胰岛数量和活性效果 上跟进口胶原酶V有一定差距（P＜0.01）,但含中性蛋白酶的国产胶原酶组在小鼠胰岛分离数量和当量上 与进口胶原酶组无差异（P＞0.05）,分离的胰岛在体内移植后降血糖效果与进口胶原酶组无差异（P＞0.05）。 结论 国产胶原酶结合中性蛋白酶可用于小鼠胰岛的分离。     

实验大鼠胰岛分离移植技术方法的比较分析

目的 探索高效的大鼠胰岛分离移植技术方法.方法 应用Wistai-Furth大鼠,于体内或体外胶原酶经胰管灌注膨化胰腺,联合不同密度Ficoll液或Histopaque液纯化胰岛细胞,评估胰岛的数量、纯度、胰岛当量以及肾被膜下胰岛移植的有效性.结果 体外经胰管灌注膨化胰腺结合Histopaque液纯化提取胰岛的数量、纯度和胰岛当量值均显著高于体内灌注组各数值(P＜0.01),其提取时间无显著差别.1000个胰岛细胞移植进入左肾被膜下,有效的逆转了糖尿病大鼠高血糖,其远期糖耐受结果优于500和800个胰岛细胞移植组.结论 体外灌注膨化消化胰腺结合Histopaque液纯化胰岛的分离方法是一种满意的分离技术.1000个胰岛细胞是保证肾被膜下胰岛移植成功的最低有效数量.     

一种快速分离纯化小鼠胰岛的方法

目的 介绍一种快速分离纯化小鼠胰岛的方法及进行纯化后胰岛的活性、完整性和胰岛内结构的质量分析.方法 雄性ICR小鼠,采用2 mg/mL胶原酶V灌注和消化,并用Hanks液快速洗涤,用Histopaque（R）-1077和Histopaque（R）-1119密度梯度离心对胰岛进行纯化,用手工方法进行胰岛挑选,DTZ、FD-PI染色鉴定胰岛纯度及其活性,透射电镜观察胰岛内的结构.结果 胰岛开始消化至手工挑选前过程耗时＜ 25 min,每只小鼠得到胰岛数量为：128±36,当量为：145±42,纯度＞90％.透射电镜显示胰岛内部血管仍有损伤.结论 采用此方法可快速得到数量较多、结构较完整的小鼠胰岛,且活性高,为进一步进行胰岛的体外质量研究及体内移植奠定了基础.     

猪胰岛的分离与纯化

目的 探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法 联合器官切取,胶原酶P主胰管灌注,COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoil纯化猪胰岛细胞.通过双硫腙(DTZ)染色,倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(275 000±20 895)胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均为(230 350±26 679)IEQ,平均每克胰腺组织可获得(2710±229)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(50.2±1.95)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的4.74倍(P≤0.001).结论 成功建立了猪胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的猪胰岛细胞具有良好的生物活性.     

小鼠胰岛分离纯化方法研究

目的探讨可提高胰岛产量和功能活性的小鼠胰岛分离、纯化的方法。方法通过胆总管逆行灌注胶原酶溶液消化小鼠胰腺,经不连续密度梯度离心后,人工挑取、纯化胰岛。过夜培养后,用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS),检测胰岛功能。电子显微镜(电镜)观察胰岛β细胞亚细胞结构变化。结果利用该改良方法平均每只小鼠可收集(200±20)个胰岛,胰岛直径大小为(175±22)μm。GSIS结果发现胰岛素水平在低糖(2.8 mmol/L)和高糖(16.7 mmol/L)刺激下分别为(0.33±0.07)、(1.36±0.47)ng/(islet·60 min),高糖刺激的胰岛素水平是低糖刺激的4.12倍,差异有统计学意义(P0.05)。电镜证实胰岛β细胞胞膜、线粒体膜完整,胞内可见大小不一的胰岛素分泌泡。结论胆总管逆行灌注胶原酶消化小鼠胰腺,体外不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法是一种简便、快捷、稳定的小鼠胰岛分离方法,小鼠胰岛产量较高、形态完整,且GSIS反应性良好。     

db/db小鼠胰岛的分离与特征分析

目的 分离db/db小鼠胰岛,并对其特征进行检测和分析。方法 采用胶原酶V对10只db/db小鼠胰岛分离进行逆行胰管灌注和消化,用Ficoll-1077和Ficoll-1119进行胰岛的不连续密度梯度纯化,对分离的胰岛进一步进行手工挑选,并用DTZ进行胰岛和纯度鉴定,用透射电镜观察胰岛内部分泌颗粒等情况。结果 经本方法分离可得到db/db小鼠胰岛数量为（122.4±6.6）个/只,当量为（483.6±82.3）IEQ/只,与ICR小鼠胰岛分离结果差异有统计学意义（P<0.05）;db/db小鼠胰岛DTZ染色后显淡红色;胰岛大小指数为（3.96±0.64）,显著大于ICR小鼠胰岛（P<0.05）;透射电镜下显示β细胞中的胰岛素分泌颗粒减少,分泌颗粒颜色较浅。结论 采用本方法可分离得到db/db小鼠胰岛,为后续开展基于胰岛功能和特征变化的2型糖尿病患者治疗研究提供一种参考。     

不同胶原酶消化对大鼠胰岛的纯化和获得率的影响

目的 比较不同胶原酶消化大鼠胰腺的效果,选择消化效果较好的胶原酶.方法 采用随机数字表法将SD大鼠分为2组,胶原酶P组大鼠胰腺使用1 mg/ml的胶原酶P液进行消化,Ⅴ型胶原酶组大鼠胰腺使用1 mg/ml的Ⅴ型胶原酶进行消化.胰腺消化后,对获得的两组大鼠胰岛进行纯化、培养.采用双硫腙染色于倒置显微镜下计数纯化前后获得的两组全部胰岛数量,并计算胰岛当量(IEQ);采用吖啶橙和碘丙啶双色荧光染色,于荧光显微镜下计数纯化后胰岛的活率;两组大鼠胰岛经纯化、培养2d后进行胰岛素释放试验,观察两组胰岛的功能.结果 纯化前,两组间每个大鼠胰腺获得的胰岛数量的差异无统计学意义(P＞0.05);但两组间IEQ的差异有统计学意义(P＜0.05);经纯化后,Ⅴ型胶原酶组和胶原酶P组每个大鼠胰腺获得的胰岛数量分别为485±113和643±82,IEQ分别为674±157和989±126,两组间胰岛数量和IEQ的比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).Ⅴ型胶原酶组和胶原酶P组大鼠胰岛经纯化后,其活率分别为(96.13±1.13)％和(96.38±0.92)％,两组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).胰岛素释放试验结果显示,在低糖或高糖刺激下,两组间大鼠胰岛功能的差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 两种胶原酶均适用于大鼠胰腺的消化,但胶原酶P消化效果较Ⅴ型胶原酶稳定,且胰岛获得率也较高.     

小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究

目的：探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法，评价其功能。方法：采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛，不连续密度梯度离心法纯化胰岛，用双硫腙（Dithizone，DTZ）对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果：胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150～250个高质量胰岛，活性〉95％，纯度〉90％。葡萄糖及茶碱（carbachol，Cch）刺激后胰岛素释放量明显增加。结论：改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法，可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。     

大鼠胰岛移植物制备与异种移植

增加胰岛收获量，提高胰岛纯度一直是胰岛移植中面临的重要问题，本实验经胰管注射胶原酶，胰静止消化分离成年大鼠胰岛纯度一直是胰岛葡聚糖离心纯化。纯化后胰岛收获量为６１０－８２０个／胰纯度达９２％；胰岛形态结构完整，内分泌细胞超微结构保持良好，对葡萄糖刺激反应胰岛素释放量是基本分泌水平的８倍；异种移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

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