RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)的N基因保守区域设计4条引物,通过优化反应条件,建立了检测IBV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,建立的RT-LAMP方法对IBV参考株扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病病毒(MDV)、传染性囊病病毒(IBDV)等的扩增产物电泳后均无扩增条带。该方法最低能检出0.19 pg的IBV cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍。用该方法检测了6份临床疑似IB临床病料,检出率为100%(6/6),与常规RT-PCR的符合率为100%。60 min反应结束后,离心可以看到白色沉淀物,简单直观,适用于基层实验室快速准确诊断。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法.     

H7亚型禽流感RT-PCR诊断方法的建立

参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp的引物。利用这对引物,通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对H7亚型禽流感的RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,最低可检出100pg的AIV-H7的mRNA,且应用该引物对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他亚型的流感病毒(H1、H3、H5、H9)在相同反应条件下未扩增出任何片段,具有较好的特异性。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子,检测结果与鸡胚病毒分离结果相比,阳性符合率高达90.6%。     

传染性支气管炎病毒(M41株)HI试验抗原的特异性和敏感性试验

采用本研究室制备的3批传染性支气管炎病毒(IBV,M41株)HI试验抗原,分别对100份和80份不同鸡血清进行IBV HI抗体检测,同时用IBV ELISA抗体检测试剂盒进行检测,比较两种不同方法检测的特异性和敏感性。结果显示,特异性试验中80份SPF鸡血清,自制抗原检测均为阴性,IBV ELISA检测79份为阴性,10份其他鸡病血清,两种方法检测9份均为阴性,10份IBV阳性血清两种方法检测均为阳性;敏感性试验中,74份已知IB疫苗免疫或IBV M41株感染鸡血清IBV HI检测72份为阳性,阳性检出率为97.3%(72/74),IBV ELISA检测74份均为阳性,阳性检出率为100%(74/74),SPF鸡血清及其他鸡病血清,两种方法检测均为阴性,两种检测方法总符合率为97.5%,差异不显著(P0.05)。试验结果证明,本研究室自制抗原具有良好的特异性,特异性为100%,抗原同时具有良好的敏感性,但IBV ELISA方法的敏感性要高于IBV HI方法。     

2019—2021年我国29个省级行政区鸡传染性支气管炎流行病学调查

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在我国的流行规律,通过RT-PCR方法,对2019—2021年从我国29个省级行政区送检的38442份疑似IBV感染样品进行病原检测和鉴定,对检出的阳性样品进行S1基因测序分型,然后对检测结果进行时间、空间和群间统计分析.结果显示:共检出6436份IBV阳性样本,阳性检出率为16.7...     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

禽白血病病毒斑点杂交检测方法的建立

为建立禽白血病病毒(ALV)斑点杂交检测方法,本研究采用RT-PCR技术扩增ALV群特异性p27抗原基因的部分片段,并以纯化的p27PCR产物为模板,合成地高辛标记探针,以此建立了ALV的斑点杂交检测方法。用该方法对4份疑似感染ALV的现地病鸡组织样品和18枚鸡胚进行检测,结果表明所有样品均为阳性,而且与PCR检测结果的符合率达到100%。该方法具有良好的特异性和敏感性,适应于ALV临床大规模检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR检测方式的建立和应用

根据GenBank传染性喉气管炎病毒(ILTV)基因序列,设计合成了1对特异性引物。以ILTV DNA为模板,建立了检测ILTV的PCR检测方法。通过优化PCR反应条件,成功扩增出一条约690 bp的目的基因片段。而鸡传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒基因组均未扩增为出相应的片段。敏感性试验检测出其DNA最小检出量为10-2μg。重复性试验中对3份检测为传染性喉气管炎病毒阳性病料进行检测,发现3次重复检测的结果完全一致。临床应用中运用上述优化的PCR反应条件进行PCR检测临床送检的16份疑似鸡传染性喉气管炎病毒感染病料,结果显示检出阳性样品6份,将阳性样品的PCR扩增产物克隆后序列分析显示均为鸡传染性喉气管炎病毒。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性,敏感性和稳定性,可应用于传染性喉气管炎病毒鉴定和临床诊断。     

检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒双重RT-PCR的建立与初步应用

为了快速检测临床样品中新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的混合感染,根据NDV的F基因和IBV的N基因保守序列分别设计了2对特异性引物,优化双重RT-PCR反应条件,建立了可同时检测NDV和IBV的快速双重反转录PCR(RT-PCR)诊断方法。敏感性试验表明,此方法对NDV和IBV的RNA最小检出量分别为0.014 3和0.013 6ng;NDV的扩增片段大小为459bp,IBV的扩增片段为282bp。对其他病毒如IBDV、AIV和EDSV的检测结果均为阴性,表明此方法具有较好的特异性。对58份临床疑似样品进行检测,NDV和IBV的阳性率分别为44.82%和31.03%,NDV和IBV混合感染率为20.68%,表明本研究建立的NDV与IBV双重RT-PCR检测方法,可用于临床发病病料中NDV和IBV混合感染的快速鉴别诊断。     

应用RT-PCR技术诊断鸡传染性支气管炎

根据已发表的IBV4／91 attenuated株S1基因序列，设计并合成了产物约600bp的IBV特异性PCR引物对。从可疑病鸡气管、肺脏或肾脏组织中提取总RNA，用AMV反转录酶反转录后，再进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。采用NDV和IBDV病料组织作阴性对照，IBV标准株M41作阳性对照。该法检测特异性强、成本低、检出率高，可有效用于鸡传染性支气管炎的早期检测和流行病学研究。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。     

鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已经发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2基因的高度保守序列,设计并合成了一对引物,Blast在线检索GenBank数据库,未发现其他相似序列。提取已鉴定的IBDV—QD株传代病毒尿囊液的总RNA,合成cDNA模板,优化RT-PCR反应条件,最终获得预期453bp的目的片段,IBDV扩增产物经测序结果证实与GenBank中已发表的致病力不同的IBDV毒株相应序列同源性达97．4％～99．9％,最终建立了RT—PCR检测方法。用已建立的RT—PCR方法对已知的8份临床IBDV阳性法氏囊病料进行检测,阳性率达100％,另外对2份鸡白血病病毒（ALDV）,2份鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）,2份鸡传染性支气管炎病毒（IBV）阳性病料进行平行同条件检测,结果均为阴性。表明所建立的RT—PCR特异性好、敏感性高,可用于鸡传染性法氏囊病的临床初步诊断及流行病学调查。     

应用RT-POR对胶东规模鸡场三种病毒感染情况的调查

为了解2009下半年山东胶东地区规模化鸡场主要疫病的感染情况,应用RT-PCR技术对山东青岛、潍坊和烟台三地区送检的774份具有呼吸道症状的病料进行了新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和H9亚型禽流感病毒(AIV)三种主要病毒的感染情况调查。调查结果显示三个地区三种病毒的感染率为25.58%,NDV、IBV和AIV(H9)的阳性率分别为8.14%、11.37%和6.07%。青岛地区NDV、IBV的阳性率均最高,分别为12.47%、14.55%。二种病毒混合感染的阳性率可达2.84%,以IBV+NDV二重混合感染临床最为常见。调查结果表明山东省胶东地区NDV、IBV和AIV(H9)的感染情况比较普遍,且存在一定程度的混合感染,这为有效预防和控制山东省规模鸡场该三种主要疾病提供了科学依据。     

Detection of avian infectious bronchitis viral infection using in situ hybridization and recombinant DNA

A recombinant DNA probe with specificity for the 3' end of genomic RNA from the Ark 99 strain of infectious bronchitis virus (IBV) was found to hybridize with extracted RNA of three strains with the Ark serotype, as well as the Mass41, Holl52, Gray, JMK, Conn, Fla and SE17 strains of IBV. Viral infection was detected in the cytoplasm of chicken embryo kidney cells inoculated with Mass41, Ark99, SE17 or two recent field isolates of IBV using in situ cytohybridization and a biotinylated probe. In vivo infections were detected in individual cells of tracheas and lungs 2,4, and 6 days after inoculation of chicks with Mass41 and Ark99. In situ hybridization of Ark99 infected tissue sections using 32P-dATP labelled probe indicated that more viral replication was present in the trachea on day 4 than either days 2 or 6; whereas more viral RNA was found in the lungs on day 6 than days 2 or 4 after inoculation.     

Tissue distribution of avian infectious bronchitis virus following in ovo inoculation of chicken embryos examined by in situ hybridization with antisense digoxigenin-labeled universal riboprobe.

Chicken embryos were inoculated with 8 different strains of infectious bronchitis virus (IBV) representing 7 different serotypes at 17 days of embryonation. At 2 and 5 days postinfection (dpi), tissues were collected for in situ hybridization using an antisense digoxigenin-labeled riboprobe corresponding to the sequence of the mRNA coding for the membrane protein. Extensive antigen staining in the cytoplasm of epithelial cells in the trachea, lung, bursa, and intestine was detected at 2 dpi with all 8 strains of IBV. At 5 dpi, little or no positive staining was observed in these tissues. However, tubular cells of the kidney showed multifocal positive staining with the Wolgemuth strain-, Gray strain-, JMK strain-, and Mass41 strain-infected chickens. No viral RNA was detected in the spleen at any time point. The results demonstrated strict epitheliotropic nature and wide tissue tropism of strains of IBV in the chicken embryo and the universality of our riboprobe. In situ hybridization with this probe will be useful for understanding the tissue tropism and the pathogenesis of IBV in vivo.     

胶东地区规模鸡场3种主要病毒感染情况的调查

应用RT-PCR对山东青岛、潍坊和烟台3个地区2008年1月至2009年6月送检的1837份具有呼吸道症状鸡的病料进行新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和H9亚型禽流感病毒(AIV)3种主要病毒感染情况的调查。调查显示,3个地区3种病毒的感染率可达65.76%,其中NDV、IBV和AIV(H9)的平均阳性率分别为12.36%、12.30%和41.10%。青岛地区NDV、AIV(H9)和IBV的阳性率最高,分别为13.45%、17.37%和44.08%。2008年下半年较2008年上半年3种病毒的检出率均有所升高,以AIV(H9)升高最为显著;2009年上半年较2008年上半年AIV(H9)阳性率上升最为明显。3种病毒混合感染的阳性率可达11.00%,以IBV+AIV(H9)和NDV+AIV(H9)二重混合感染临床最为常见。表明山东省胶东地区NDV、IBV和AIV(H9)的感染情况比较普遍,且存在一定程度的混合感染。本调查结果为山东省制定规模鸡场3种疫病的防控措施提供了科学资料。