黄肉桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的全长核苷酸序列,命名为PpPDS。PpPDS全长2 056bp,编码区长度1 722bp,共编码573个氨基酸。进化树分析发现PpPDS与杏果实PaPDS、草莓FaPDS亲缘性较高。蛋白质序列分析表明PpPDS含有二核苷酸[NAD(H)/NADP(H)或FAD(H)]结合基元,其处于NAD(P)-binding Rossmann-like保守结构域内。实时荧光定量PCR结果显示,PpPDS基因在黄肉品种‘金丽’桃果实发育过程中均有表达,且在果肉中的表达普遍高于果皮。果实处于硬核期的PpPDS基因在果实中的表达显著高于软核果时期,随后其表达处于较高水平并呈平缓趋势。本研究对桃果实PpPDS基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。     

青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)为Ca²⁺传感蛋白,在植物生长发育和逆境响应中起着重要作用。在克隆青花菜BoCDPK1基因的基础上,开展序列分析、系统发育分析和表达分析,为后续的基因功能鉴定和抗逆育种奠定基础。该研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆1个CDPK 基因,利用生物信息学对序列进行分析,并采用qRT-PCR研究该基因在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式。测序结果表明,BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp,具6个内含子,编码区全长为1 647 bp,编码548个氨基酸;BoCDPK1有1个S_TKc和4个EF手性结构域。多序列比对结果表明,BoCDPK1与芸薹属植物同源序列的相似性最高,仅个别氨基酸残基存在差异,它们在系统发育树上聚于一组。qRT-PCR结果表明,BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,表达量均呈现先上升后下降的规律。在霜霉菌的诱导下,BoCDPK1的表达量在72 h达最大值,为对照的3.4倍;而在核盘菌侵染下,BoCDPK1的表达量在36 h达最大值。该研究明确了青花菜BoCDPK1基因的序列特点、系统发育关系和表达特征。     

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(PpZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考.[方法]从黄肉品种桃果实中克隆PpZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况.[结果]克隆获得的PpZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸.PpZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGA-GLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域.PpZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小.整个桃果实成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的PpZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中PpZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05).[结论]PpZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用.     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR）是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca²⁺的释放,对细胞内Ca²⁺的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因（CsRyR）全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-qPCR技术,解析CsRyR在桃小食心虫各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）的表达模式。【结果】桃小食心虫CsRyR的cDNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,CsRyR与脊椎动物RyRs的一致度分别为45%-47%;与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RyR的一致度也为46%。在昆虫RyRs中,与鳞翅目一致度为91%-94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫RyRs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,CsRyR具有RyR的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域（AA 4 467-5 029）、释放Ca²⁺的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca²⁺结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290（BmRyR）,AA 4 610-4 655（DmRyR）和4 946G（PxRyR）在CsRyR中无特殊性。此外,CsRyR中存在AA 2 490- 2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-qPCR分析结果表明,CsRyR在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了CsRyR基因全长cDNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。     

桃PpCBF2基因克隆及其响应低温表达特性研究

为探讨桃品种间抗寒差异的分子基础,以野生毛桃(Prunus persica)和17个桃品种和品系为试验材料,通过PCR与RT-PCR克隆PpCBF2基因;并利用qRT-PCR分析‘早红霞’和‘大久保’叶片中PpCBF2在低温下的表达特性。结果表明:1)毛桃PpCBF2基因的DNA和cDNA全长序列均为894bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸并且含有CBF家族的AP2/EREBP功能域;2)供试的17个桃品种和品系的PpCBF2基因核苷酸序列全长和编码氨基酸数目与毛桃相同,但有9个品种发生1～2个氨基酸位点突变:其中‘白芒蟠桃’、‘81715’和‘大久保’的突变发生在N-豆蔻酰化位点或酪蛋白激酶II磷酸化位点;‘Italia 3’、‘寒露’和‘B6832’的突变发生在AP2/EREBP功能域;3)‘早红霞’和‘大久保’PpCBF2基因均被低温诱导,品种间表达水平有显著差异。综上,该基因在桃品种间进化较为保守,但少数品种基因功能位点发生了突变;该基因被低温显著诱导,与抗冷性有关。     

鸭梨PAL克隆及其在果实发育和机械伤害过程中的表达

【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906268.1;PbPAL2 cDNA序列全长为2 387 bp,含2 163 bp完整开放阅读框、14 bp的5′非翻译区及210 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906269.1。系统进化分析表明PbPAL1和PbPAL2位于分子进化树的不同分支,PbPAL1与西洋梨（Pyrus communis）的PAL同源性较高,而PbPAL2与桃（Prunus persica）的PAL同源性较高。定量PCR分析表明,随着鸭梨果实发育成熟,果皮、果肉和果心的PbPAL1和PbPAL2表达量各异,但均呈下降趋势;且果实发育早期果心中的PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉。损伤处理可迅速诱导鸭梨的果肉褐变,果皮褐变出现较晚;同时,损伤刺激果皮和果肉组织中PbPAL1和PbPAL2表达上调。果皮中PbPAL1表达量在损伤处理后6 h达到高峰,而PbPAL2在损伤处理后48 h才显著上升;果肉中PbPAL1在损伤处理后1 h表达量开始显著上升,而PbPAL2在损伤处理后12 h才显著上升。【结论】鸭梨PbPAL1和PbPAL2属于2个不同的PAL类型,其表达随果实发育呈下降趋势,机械损伤过程中,两基因表达显著上调,表明其参与了损伤引起的组织褐变过程。     

葡萄STS基因家族的鉴定与表达分析

白藜芦醇等芪类化合物与人类健康和植物抗逆性密切相关,芪合成酶(stilbene synthases,STS)是合成该类化合物的关键酶。为进一步明确葡萄中STS基因家族的表达特性,利用生物信息学技术,筛选了葡萄中的STS基因,并分析了其在果实生长过程和不同时期叶片中的表达模式。结果表明:葡萄全基因中共鉴定出48个STS基因,这些基因串联分布在10和16号染色体,其中32个STS基因能编码完整的氨基酸序列,且编码的氨基酸序列均为392 bp。根据氨基酸序列特性,可以将这些STS基因分为3类。在葡萄果实生长过程中,STS基因家族成员呈现出多种表达模式,但大多数STS基因在花后20~40 d和花后70~80 d的表达水平较高。大部分STS基因在葡萄叶片成熟阶段或衰老阶段表达水平较高。     

橡胶树PEPC基因的克隆、生物信息学和表达分析

【目的】克隆橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的全长cDNA,通过生物信息学和基因表达分析,为基因功能研究奠定基础。【方法】根据橡胶树PEPC基因片段序列设计引物,通过RACE获得cDNA全长,用DNAMAN软件预测编码多肽序列,用Prot Param工具分析多肽基本理化性质,用NCBI-Blast工具搜索同源的核酸及多肽序列,用Clustal X2.0软件比对不同植物来源的多肽序列,并用MEGA 6.06软件构建系统进化树,用Real-time RT-PCR分析基因表达模式。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到一个新的PEPC基因的全长cDNA,其长度为3206 bp,包含一个2898 bp的开放读码框(ORF),112 bp的5’UTR和196 bp的3’UTR。预测该基因编码965个氨基酸的多肽(HbPPC2),其分子量为110.35 kDa,等电点为5.76;该基因的编码区核苷酸序列和其编码多肽氨基酸序列分别与早期克隆的橡胶树HbPPC1基因(KJ721228)的编码区和编码多肽序列有81.3%和92.1%的同源性。预测HbPPC2定位于细胞质,为不稳定蛋白,其活性受多种因素调控。预测HbPPC2酶活性中心是其第172位残基His,磷酸化位点是其第11位残基Ser,单泛素化位点是其第628位残基Lys。其第178、179、226和366位残基Arg在三维结构中靠近,构成葡萄糖-6-磷酸(G6P)的结合位点;其第450、641、753、767位残基Arg在三维结构中靠近,构成PEP的结合位点。HbPPC2基因在叶片、树皮、胶乳、雄花、雌花均有表达,在胶乳表达量最高;乙烯利处理显著下调该基因在胶乳的表达。【结论】本研究可为橡胶树PEPC功能研究提供理论基础。     

葡萄风信子黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

以葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶、花为材料,采用RT-PCR技术克隆得到一条FLS基因,命名为MaFLS2。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长为1 152 bp,含有完整的开放读码框1 056 bp,编码353个氨基酸,MaFLS2蛋白是一种亲水性蛋白,氨基酸序列含有典型的DIOX_N结构域(2-酮戊二酸-双加氧酶活性的N端区域)和2OG-FeII_Oxy超家族结构域,属于2-酮戊二酸-双加氧酶(2-ODDs)蛋白家族。实时定量PCR结果显示,MaFLS2基因在蓝白葡萄风信子中的表达存在组织特异性,蓝色品种‘亚美尼亚’中在花蕾未着色时表达量最高,而白色品种‘白丽人’在根中表达量最高, 在花发育的不同阶段,MaFLS2基因在‘亚美尼亚’中的表达峰值出现在花蕾未着色时期,基因表达总体呈现出先降低后升高再降低的趋势,而在‘白丽人’中的表达峰值出现在转色中期,总体呈现出先升后降的趋势。研究结果为开展单子叶植物花色育种提供了理论依据。     

河川沙塘鳢GH基因及侧翼的克隆与生物信息学分析

利用长片段PCR、基因组步移法及T-A克隆技术,成功克隆出河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)GH基因全长序列,提交至GenBank获得登录号MH717101。河川沙塘鳢GH基因全序列长5 120 bp,5'端和3'端侧翼序列长度分别为920、682 bp,经预测,上游区域含有MF3、GAGA factor、HNF-3alpha、C/EBP、R2、GATA-1等多种转录调控元件;转录单元长3 518 bp,包含4个内含子和5个外显子,4个内含子大小分别为75、333、2 070和121 bp,5个外显子长度分别为150、131、117、138和373 bp,第3内含子长达2 070 bp,其长度是翘嘴鲌(Culter alburnus)第3内含子的4倍以上;开放阅读框区(open reading frame,ORF)为594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。河川沙塘鳢与鲈形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等13种鱼类的氨基酸序列同源性比较表明,其与彼氏冰鰕虎鱼(Leucopsarion petersii)同源性最高,为83.8%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)同源性最低,为49.1%,在180~197氨基酸序列处,河川沙塘鳢表现出高度不保守性,与所列鱼类氨基酸排列均完全不一致。该研究结果为进一步研究河川沙塘鳢GH基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH结合区蛋白的原核表达、纯化及复性

为了剖析桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH蛋白的结合活性,从桃果实中提取总RNA,采用RT-PCR方法,以桃果实RNA逆转录的cDNA为模板,扩增出ABAR/CHLH基因的结合区功能片段C369,回收目的片段并测序,基因片段长度为1 121 bp,编码369个氨基酸残基,分子量约为40 kD。利用BamHⅠ和NotI酶切位点将该片段编码区插入原核表达载体pET-28a（＋）中,构建ABAR/CHLH基因片段原核表达载体pET28a-C369,经菌落PCR和测序确证后,转化E.coliRosetta（DE3）,通过IPTG诱导其表达His-CHLH融合蛋白。通过SDS-PAGE检测及Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,并用纯化复性的His-CHLH C369融合蛋白制备抗体。     

花楸树热激蛋白SpHSP70-2基因的克隆及表达分析

探究花楸树响应高温胁迫的分子机制,为遗传改良和耐热品种的选育提供基础,依托花楸树叶片转录组测序数据,采用反转录PCR（RT-PCR）方法克隆得到HSP70家族中的1个基因,命名为SpHSP70-2,同时对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对其组织特异性和应答高温胁迫的表达模式进行了分析。结果表明,经克隆得到的SpHSP70-2基因与花楸树叶片转录组测序数据的基因序列一致,SpHSP70-2开放阅读框（ORF）长度为1 704 bp,编码567个氨基酸。SpHSP70-2蛋白具有HSP70特征结构域:核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）;SpHSP70-2基因无内含子;SpHSP70-2二级结构中具有ɑ螺旋（32.63%）、延伸链（23.28%）、β转角（7.23%）和随机卷曲链（36.86%）;SpHSP70-2蛋白为疏水性蛋白,有11个跨膜螺旋,无信号肽;SpHSP70-2与同科的苹果、白梨的HSP70同源性最高,为90%以上;SpHSP70-2在花楸树的果实中表达量最大,在茎、根中表达量次之,在花中的表达量最小;在42℃高温胁迫处理下,SpHSP70-2表达量呈现先升高后下降趋势,在2 h时达到极值,随后表达量略缓慢下降,说明SpHSP70-2基因参与调控花楸树对高温胁迫的响应。研究结果为今后花楸树响应热胁迫的分子机制研究和引种驯化方面提供基础。     

青花菜BoBURP1基因的克隆与表达分析

BURP是一类存在于植物中的特有蛋白,在生长发育和逆境响应等方面起重要作用。试验从青花菜中克隆到一个BURP基因,命名为BoBURP1,在生物信息学分析的基础上,用RT-PCR研究了它在不同器官中的表达模式。研究结果表明,BoBURP1的基因组DNA全长2 030 bp,具2个内含子;编码区全长为1 872 bp,编码623个氨基酸;推导的蛋白质分子量为70.795 6 ku,等电点为8.65。系统发育分析结果表明,BoBURP1与12种不同植物的同源蛋白可分为3组,BoBURP1与十字花科植物同源序列的相似性最高,在进化树上聚为一组。RT-PCR结果表明,BoBURP1在根、茎、叶、花蕾、花和角果中均有表达,叶、花蕾和花的表达量最高,而根和茎中的表达量最低。     

In Silico Cloning and Sequence Analysis of Phospholipase Dα Gene from Peach Fruit

Phospholipase D （PLD, EC 3.1.4.4） plays an important role in adaptive response of postharvest fruit to environment. In this study, a novel cDNA of PLDα was isolated with the strategy of in silico cloning in combination with RT-PCR from peach （Prunus persica L. cv. Jiubao）. The obtained PLDα gene contained a complete open reading frame encoding a 92- kDa protein of 810 amino acid residues, which possessed the characteristic C2 domain and two catalytic HKD motifs. The alignment analysis of the deduced peach PLDa protein with other known PLDα family proteins indicated that peach PLDα was conserved and highly homologous with strawberry PLDα. Semi-quantitative RT-PCR and Northern blot analysis indicated PLDα mRNA in peach fruits could be induced by low temperature. This work provided a scientific basis for further investigating the mechanism of postharvest fruit adaptation to low temperature.