MCF-7细胞中组织型纤溶酶原激活剂乳腺特异性表达载体的瞬时表达

目的：验证所构建的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺特异性表达载体pWTA在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达。方法：用脂质转染胺试剂Lipofectamine^TM2000将pWTA DNA转染人乳癌细胞系MCF-7和食管癌细胞系Eca-109。应用原位杂交技术,以地高辛标记的tPA cDNA为探针,观察PWTA的瞬时表达。结果：不同浓度Lipofectamine^TM2000 MCF-7细胞原位杂交均为阳性;Eca-109细胞及未加转染液者未见阳性信号。结论：载体pWTA为tPA乳腺特异性表达载体。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA克隆及其乳腺特异性表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活剂(tissue—type plasminogen activator,tPA)基因及构建其乳腺特异性表达载体。方法：以PCR技术克隆2．1kb tPA cDNA片段;应用体外连接技术,连接乳腺特异性表达载体pWA和2.1 kb tPA cDNA片段;转化连接产物,以内切酶酶切、琼脂糖电泳及插入片段序列分析鉴定阳性克隆。结果：琼脂糖电泳显示,2．1 kb tPA cDNA片段克隆成功;内切酶酶切片段与预期片段长度一致;插入片段序列与文献报道一致。结论：tPA基因克隆及其乳腺特异性表达载体构建成功。     

乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白(人组织型纤溶酶原激活剂（WAP-tPA）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中tPA的表达量为80 ng/ml。结论 此方法可以作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白－人组织型纤溶酶原激活剂（ＷＡＰ－ｔＰＡ）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中ｔＰＡ的表达量为８０ｍｇ／ｍｌ。结论 此方法可作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究

目的 构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体，使其在牛乳汁中高效表达，从而建立牛乳腺生物反应器。方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因，通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体：采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果 显微注射法和乳腺注射法转基因后，t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达，t-PA基因的表达不受转基因方法的影响，但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量。提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异，可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响

目的 研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率.方法 将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48h后分别取血和肝组织,通过荧光显微镜观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响.结果 流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P>0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但3组内脂质体/质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P<0.05).结论 应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体/质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染.     

GH/tPA双转基因小鼠的制备及其表达分析

目的 旨在获得GH/tPA双转基因小鼠,并比较分析小鼠乳腺中人组织纤溶酶原激活剂（tPA）的表达水平和个体生长发育状况。方法 利用2只tPA单转基因雄性小鼠（P03、P05）与经超数排卵处理的正常非转基因雌性小鼠交配,受精卵显微注射线性化的GH质粒、胚胎移植而获得后代小鼠,PCR检测基因整合情况,ELISA和Western blotting检测比较单、双基因表达tPA水平,监测转基因小鼠不同生长阶段的体质量来分析GH基因对小鼠生长发育的影响。结果 P03系小鼠共获得286枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔77只,经PCR检测获得16只tPA单转基因小鼠（7♂,9♀）,13只GH/tPA双转基因小鼠（8♂,5♀）,双基因整合率为16.9%;P05系小鼠共获得175枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔34只,经PCR检测获得12只tPA单转基因小鼠（5♂, 7♀）,7只GH/tPA双转基因小鼠（3♂,4♀）,双基因整合率为20.6%。单、双转基因小鼠乳腺中表达tPA的最高量分别为82.5 μg/mL、674 μg/mL,GH/tPA双转基因小鼠乳腺中表达tPA的量明显高于tPA单转基因（P<0.05）。在小鼠的整个生长周期内,单、双转基因与正常非转基因小鼠的体质量增长均没有显著的差异（P>0.05）。结论 本实验成功地制备了GH/tPA双转基因小鼠,结果表明GH基因导入小鼠体内能够显著地提高目的基因tPA的表达水平,且不会对转基因小鼠的生长发育造成任何明显的影响,这为将来制备高表达转基因动物生产医药蛋白及其育种奠定了基础。     

人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究

目的 构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体,使其在牛乳汁中高效表达,从而建立牛乳腺生物反应器。方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体;采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果 显微注射法和乳腺注射法转基因后,t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达,t-PA基因的表达不受转基因方法的影响,但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

Expression of human tissue-type plasminogen activator in cow mammary gland]

OBJECTIVE: To construct an expression vector for highly efficient expression of tissue-type plasminogen activator (t-PA) confined in the mammary gland of cow to develop a cow mammary gland bioreactor. METHODS: RT-Touch down-PCR was employed to amplify human tissue-type plasminogen activator (t-PA) cDNA, which was digested with the restriction enzymes and subsequently cloned into the vector pSP72 for constructing specific fusion gene only expressed in the mammary gland. The fusion gene was then transferred into the mouse zygote and the mammary gland tissue of mice and cows. RESULTS: t-PA was detected in the milks of mice and cows after the transgenic manipulation with microinjection and mammary gland injection of the fusion gene. CONCLUSIONS: The vector we constructed can effectively induce t-PA expression in the mammary gland, which is not influenced by different transgenic methods. The expression level of t-PA, however, is significantly higher in the milk of cows than in the milk of mice, suggesting the species-specific difference in milk protein regulating system possibly is due to different factors and regulatory systems.     

MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤乳腺癌细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养小鼠乳腺肿瘤病毒介导多瘤病毒中间T抗原（MMTV-PyMT）转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞,初步研究其生长特性、分子表型、体内成瘤和转移能力。方法：取MMTV-PyMT小鼠自发成瘤的乳腺癌组织（n=3）,采用酶解贴壁培养法进行原代细胞分离并传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态特征;采用CCK-8检测细胞的增殖能力;通过Western印迹检测细胞的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2(HER2)表达以鉴定细胞分子亚型。将分离培养的细胞接种于C57BL/6雌性小鼠（n=4）乳腺脂肪垫,观察细胞成瘤能力和生长特性;取肿瘤组织和内脏器官,制备组织切片后采用苏木精-伊红（HE）染色,观察组织形态学特点;采用免疫组织化学（IHC）染色检测ER、PR、HER2及Ki-67蛋白表达,分析分子分型。结果：成功分离得到MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞（MMTV-PyMT细胞）并可稳定生长和传代,细胞倍增时间为56.0 h;MMTV-PyMT细胞可在C57BL/6雌性小鼠乳腺脂肪垫成瘤并生长,但未见远处内脏转移。该细胞在细胞学和组织学中的分子分型皆为HER...     

EGF对小鼠角质形成细胞中组织型纤溶酶原激活剂表达的调节

目的 探讨小鼠表皮角质形成细胞（KC）中,EGF对组织型纤溶酶原激活剂（tPA)表达的影响。方法 应用免疫组化及原位杂交技术, 结合图像分析,定性及定量检测在EGF作用下的小鼠表皮角质形成细胞中,tPA mRNA/蛋白质的表达。结果 小鼠表皮KC经EGF处理12、24、48、72h后,tPAmRNA/蛋白质的量均增加（P＜0．01）,tPAmRNA的表达的 高峰出现于EGF作用24h时,tPA蛋白质表达的高峰则出现于EGF作用48h时。EGF联合0．5、1．0、1．5mmol/L Ca^2 作用小鼠表皮KC48h,与EGF单独作用小鼠表皮KC48h时,tPAmRNAA／蛋白质的表达,均显著降低（P＜0．001）。结论 小鼠表皮KC中,EGF可以时间依赖方式促进 tPAmRNA／蛋白质的表达,但受Ca^2 浓度的影响。     

乳癌组织中Bcl-2蛋白的表达

目的 :探讨乳癌组织中Bcl 2蛋白的表达。方法 :采用免疫组织化学方法检测 69例乳癌组织中Bcl 2蛋白 ,P53蛋白 ,雌激素受体 (ER) ,孕激素受体 (PR)的表达及 1 5例正常乳腺组织Bcl 2蛋白的表达。结果 :Bcl 2蛋白 ,P53蛋白 ,ER ,PR在乳癌组织中表达的阳性率分别为 65 .2 % ,47.5 % ,75 .4 % ,69.6 % ;Bcl 2蛋白在正常乳腺组织中的表达 1 0 0 % ;Bcl 2蛋白表达与肿瘤体积大小 ,ER、PR、P53蛋白及病理组织学分级有密切关系 (P均 <0 .0 5) ;而与腋下淋巴结转移无关 (P >0 .0 5)。Bcl 2蛋白表达阳性 ,5a生存率高 ;Bcl 2蛋白表达阴性 ,5a生存率低。结论 :Bcl 2蛋白表达与乳癌预后密切相关 ,5a生存率高 ;Bcl 2蛋白对判断乳癌预后具有重要的临床价值     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。