硫酸软骨素促进成肌细胞增殖作用的研究

目的探讨硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)对成肌细胞增殖以及肌管形成的影响。方法取第5代成肌细胞制成浓度为1×108个/L的细胞悬液,依据在成肌细胞培养基中添加不同浓度CS,将实验分为A组(0μg/m L)、B组(50μg/m L)、C组(100μg/m L)和D组(200μg/m L)。干预4、5、8 d于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化及肌管形成情况,6 d采用MTT法检测各组细胞增殖情况,8 d行HE染色检测各组细胞肌管形成数。结果倒置显微镜观察示,细胞贴壁后呈单核梭形,细胞核呈卵圆形,细胞质致密;贴壁90%时整体肌母细胞呈漩涡状走行,长梭状生长。继续培养成肌细胞细胞核出现融合现象,形成多核肌管。8 d,A组细胞多数已融合形成肌管,B、C组细胞有部分未融合,D组细胞融合形成肌管数最少。MTT检测示,A、B、C、D组活细胞吸光度(A)值分别为0.045 2±0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0±0.039 0,A组显著小于B、C、D组,B、C组小于D组,差异均有统计学意义(P0.05);B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组细胞大多数已融合形成肌管;B、C组有少部分细胞未融合形成肌管;D组细胞融合形成肌管数相对最少,未融合细胞数稍多。A、B、C、D组肌管形成数分别为(222.01±30.02)、(193.13±42.46)、(170.26±11.96)、(136.88±16.78)根,各组间比较差异无统计学意义(F=1.658,P=0.252)。结论 CS显著促进成肌细胞增殖,200μg/m L CS促成肌细胞增殖能力显著优于其他浓度。     

脊索细胞促进髓核软骨样细胞增殖及表型维持

目的分离纯化兔髓核中的细胞成分，观察脊索细胞形态及对软骨样细胞增殖及细胞表型的影响。方法6只4周龄新西兰兔胸腰段脊柱，获取髓核，0．2％Ⅱ型胶原酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化脊索细胞及软骨样细胞。实验分为单纯软骨样细胞培养组（A组）及脊索细胞、软骨样细胞（1：1）共培养组（B组）。倒置相差显微镜观察两组细胞生长情况，测定两组原代及传代细胞成活率，MTT法测定两组第2代细胞增殖曲线，并以甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色鉴定两组原代及传代细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果成功分离、纯化脊索细胞和软骨样细胞。细胞培养观察，原代脊索细胞直径10～15gm，胞浆内富含大小不等的囊泡；原代软骨样细胞直径4～6gm，胞浆内无囊泡。各代细胞成活率A组为89．0％～95．3％，B组为91_3％～96．3％，各代细胞成活率两组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A组细胞培养3～4d进入对数生长期，B组细胞培养2d后进入对数生长期；培养4d后，B组细胞增殖能力高于A组，差异有统计学意义（P〈0．05）。A组3代以内细胞表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原，B组细胞表型维持至5代。结论脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖及表型维持；脊索细胞可能在防止椎间盘退变中具有重要意义。     

可溶性载体复合成肌细胞移植对胫前肌深度冻伤的修复作用研究

目的探讨利用可溶性载体能否提高成肌细胞移植对胫前肌深度冻伤的修复效率。方法采用酶消化法分离出新生SD大鼠的骨骼肌成肌细胞,经纯化并传代培养,取第3代细胞用BrdU标记。取84只5月龄SD大鼠,建立胫前肌深度冻伤模型,随机分为4组,分别植入含0.1%透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞(A1组),不含透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞(A2组),含0.1%透明质酸钠的F12培养基载体溶液(B1组)及不作任何处理作对照组(B2组)。分别于术后2、5、9d,2、4、8、12周各处死大鼠6只,通过免疫组织化学和Mallory三色染色观察冻伤组织的修复情况,通过图像分析比较第2天各组细胞存留数和第8周各组胶原纤维面积比。结果BrdU免疫组织化学染色显示,各时间点A1组移植细胞在受体的存留数明显高于A2组,成肌细胞的迁移范围更大,细胞分布更均匀,细胞的分化潜能未受到破坏,移植效率得到提高。B组各时间点未见蓝染的细胞核。Mallory三色染色法显示A1、A2及B1组冻伤组织修复过程中的纤维化明显受到抑制。抑制作用在A1组最明显,其次是A2组。图像分析提示术后第2天A1组移植细胞存留数明显大于A2组(P<0.05),术后第8周各组胶原纤维面积A1组最少,A2组其次,B1组较多,B2组最多(P<0.05)。结论成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用,以0.1%透明质酸钠溶液为载体可提高成肌细胞移植效率。     

经诱导的大鼠成肌细胞应用于组织工程化人工骨的实验研究

[目的]探讨骨形态发生蛋白诱导的大鼠成肌细胞应用于组织工程化人工骨修复大鼠胫骨缺损的效果。[方法]32只体重在200~250 g的雄性SD大鼠随机分成4组,每组8只。A组:聚乙烯管内植入诱导2周的成肌细胞复合透明质酸钠。B组:聚乙烯管内植入成肌细胞复合透明质酸钠。C组:聚乙烯管内植入透明质酸钠。D组:聚乙烯管内注入生理盐水。术后12周,进行X线观察、大体观察、组织学观察(HE染色)以及四环素和钙黄绿素标记。[结果]术后12周时大体观察发现,A、B组骨缺损处可见大量类骨样组织填充,未触及反常活动,C、D组可见少量胶冻样组织及类骨样组织填充,无反常活动。X线观察可见A和B组骨痂吸收,髓腔再通,C、D组有少量新骨痂,髓腔未通。组织学观察可见A和B组有大量新生骨小梁,四环素和钙黄绿素染色可见黄绿色荧光。[结论]初步结果显示经诱导的大鼠成肌细胞可作为骨组织工程的种子细胞,用于修复骨缺损。     

微管仿生人工骨对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

[目的]研究不同微管结构仿生人T骨对犬骨髓基质细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。[方法]仿生人工骨分为正交结构（A组）和同心结构（B组），以磷酸钙骨水泥（CPC）／重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）（C组）、单纯CPC（D组）为对照组：梯度密度离心法获取犬骨髓单个核细胞，取第3代与人工骨复合培养。通过荧光显微镜、扫描电镜观察细胞在人工骨表面附壁和生长情况；以MTT实验检测各组细胞增殖能力；测定碱性磷酸酶（ALP）检测BMSCs的成骨活性：[结果]细胞在各组人工骨表面黏附、生长，以A、B组数量较多；MTT法检测显示A、B、C组吸光度（A）值大于D组（P〈0．05）、A、B、C组A值相似（P〉0．05）；ALP测定显示ALP活性A、B组〉C组〉D组（P〈0．05），A、B组间差异无统计学意义（P〉0．05）。[结论]微管结构仿生人工骨与犬BMSCs有良好的生物相容性，是BMP的良好缓释载体，可以促进犬骨髓基质细胞向成骨方向分化.     

IGF-1 促原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的研究

目的为更好地将成肌细胞应用于组织工程构建，探讨IGF-1对原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的作用与机制。方法通过核素。H-TdR掺入法测定不同浓度IGF-1（1、2、4、8、16和32ng／mL）作用下成肌细胞的每分钟射线脉冲数（count per minute，CPM）值，根据浓度-CPM值量效曲线确定IGF-1促增殖的适宜浓度。在生长培养基中加入该浓度的IGF-1用于实验组细胞，对照组细胞仅接受生长培养基。分别观察实验组与对照组生长曲线，比较两组细胞增殖周期的变化。运用流式细胞技术及核素掺入法测定适宜浓度IGF-1作用下，成肌细胞增殖周期的变化。另选取不同浓度IGF-1（0、5、10、15、20、25、30ng／mL）作用于成肌细胞，观察4d后成肌细胞融合率，通过融合率．IGF-1浓度．量效曲线确定IGF-1促进成肌细胞融合的最佳浓度，并将其用于实验组，而未接受该浓度IGF-1的成肌细胞作为对照组，分别测定两组细胞融合率与磷酸肌酸激酶（creatinekinase，CK）含量并进行比较。结果5ng／mL的IGF-1为促成肌细胞增殖最佳浓度。对照组成肌细胞倍增时间为96h；实验组成肌细胞生长曲线左移，倍增时间缩短为60h。对照组DNA G1、S期与G2M期各亚周期所占时间分别是70．03、25．01与0．96h，实验组为22、66、16．47与20．87h。实验组与对照组成肌细胞CPM峰值出现的时间分别是48h与96h，与生长曲线流式细胞技术测定结果一致。IGF-1促进分化研究显示20ng／mL IGF-1为促成肌细胞分化最佳浓度。实验组成肌细胞融合率较对照组提高30％，CK合成量提高2000mU／mL。结论IGF-1对成肌细胞的增殖与分化均具有促进作用，是通过减少G1期成肌细胞数量，增加S期与G2M期细胞实现的。20ng／mLIGF-1能明显增加成肌细胞融合率CK合成。     

RNA干扰靶向抑制表皮生长因子受体表达对大肠癌细胞增殖的影响

目的观察RNA干扰（RN加）技术能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的表达以及对细胞增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2；脂质体瞬时转染后24、48、72、96、144h实时荧光定量PCR（Real Time PCR）和Western blot检测EGFR表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，并绘制细胞生长曲线；分5组：A组：Lov0细胞组；B组：Lipofectamine2000组；C组：对照载体HK组；D组：pU6-EGFR-shRNA-1组；E组：pU6-EGFR-shRNA-2组。结果D组E组细胞转染shRNA后mRNA和蛋白表达降低，G0～G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，对数生长期延迟，以48h效果最显著，和A组B组C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；但随着时间的推移其干扰作用降低。结论两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达，阻滞更多的细胞位于Go～G1期，促进细胞凋亡而抑制细胞增殖。     

凝胶化改性壳聚糖膜预防腹膜粘连的效果研究

目的对比研究凝胶化改性壳聚糖膜和透明质酸钠对腹膜粘连的预防作用。方法SD大鼠80只,随机分成4组：假手术对照组（A组）,生理盐水对照组（B组）,凝胶化改性壳聚糖膜组（C组）,透明质酸钠组（D组）。利用大鼠蚓突盲端制作创伤性腹膜粘连模型,然后每组分别用相应的方法处理创面,处理后第2周和第4周打开腹腔,以Bhada分级法评定蚓突盲端的粘连程度,并对盲端组织行羟脯胺酸（OHP）水平测定和病理组织学检查。结果术后第2周和第4周,C,D组的粘连程度均显著轻于B组（P=0．001～0．013）,OHP水平显著低于B组（P=0．037～P〈0．001）;C组和D组比较,粘连程度分级的差异两组间无显著性意义（P〉0．05）,但OHP含量C组显著低于D组（P=0．005,0．002）。病理学检查：A组所有大鼠蚓突组织无明显的病理改变,B组术后第2周时处理侧浆膜面有明显的炎症细胞浸润和纤维组织增生,术后第4周局部主要以纤维组织增生为主;相应的病理改变C,D组较B组明显减轻,C组的病理改变又明显轻于D组。结论凝胶化改性壳聚糖膜具有明显的抗腹膜粘连作用,且此作用较透明质酸钠具有优势。     

RNAi阻断人膀胱癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3的表达研究

目的探讨RNA干扰技术阻断人膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3（hyaluronic acid synthase 3，HAS3）的表达与膀胱移行细胞癌生物学行为之间的关系。方法设计、体外化学合成HAS3 mRNA序列特异性、非特异性小干涉双链RNA（small interferencing RNA，siRNA），分别与脂质体LipofectamineTM 2000结合后转染体外培养的人膀胱移行细胞癌组织中的成纤维细胞。实验分为A、B、C、D四组：孵育48h后，取各组细胞培养液进行放免法透明质酸浓度测定、免疫细胞化学染色了解透明质酸的合成、RT—PCR法检测HAS3 mRNA的表达。结果与A组相比，D组细胞HAS3 mRNA表达减少了78．2％，HA染色明显变淡，细胞培养液中HA浓度下降了60．3％（P〈0．01）；B、C组mRNA表达分别减少了4．7％、5．4％，HA染色几乎无变化，HA浓度分别下降了5．2％、5．8％（P〉0．05）。结论RNA干扰技术可以显著地减少膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞的HAS3的表达，从而大幅度地降低该细胞内透明质酸的合成。     

颈椎前路单节段减压四种不同融合方式的疗效比较

目的比较颈椎前路单节段减压并不同融合方法治疗脊髓型颈椎病（cervical spondylotic myelopathy，CSM）的临床疗效。方法对168例单节段病变的CSM患者采用前路减压并植骨融合治疗，其中单纯植骨融合42例（A组）、颈椎前路减压界面固定术（cervical interbody fusioncage，CIFC）54例（B组）、植骨融合并颈椎前路钢板内固定40例（C组）、CIFC并前路钢板内固定32例（D组）。术后定期随访并摄X线片，观察疗效、椎间高度、颈椎前弯曲度和融合情况。结果经过随访，A组融合率为83．3％，B组融合率为96．3％，C组融合率为95．0％，D组融合率为96.9％。终访时，A组平均椎间高度和颈椎前弯曲度较术后早期显著降低（P〈0．05），B组、C组和D组则无显著差异（P〉0．05）。结论脊髓型颈椎病的治疗关键不仅在于充分减压及有效植骨融合，而且不同融合技术对疗效有明显影响。     

几丁聚糖和透明质酸钠对成纤维细胞增殖影响的实验研究

目的：比较几丁聚糖和透明质酸钠对成纤维细胞增殖的影响。方法：用含不同浓度的几丁聚糖和透明质酸钠的培养液培养成纤维细胞，以四唑盐比色法测细胞增殖，并用流式细胞仪测细胞周期。结果：几丁聚糖在≥0.1mg/ml时即对成纤维细胞的增殖有抑制作用，透明质酸钠的抑制浓度为1mg/ml，透明质酸钠和几丁聚糖都可使细胞周期中G1期比例增加。结论：几丁聚糖和透明质酸钠均抑制成纤维细胞的增殖，但几丁聚糖的抑制作用较强。     

Effects of sodium hyaluronate on epithelial healing of the vesical mucosa and vesical fibrosis in rabbits with acetic acid induced cystitis.

PURPOSE: To evaluate the effect of sodium hyaluronate on epithelial healing of the vesical mucosa and vesical fibrosis, and clarify the effect of the sodium hyaluronate solution concentration, we administered sodium hyaluronate in the bladder of rabbits with acetic acid induced cystitis. MATERIALS AND METHODS: Sodium hyaluronate at 3 concentrations (0.1%, 0.2% and 0.4%) was injected intravesically into rabbits with cystitis. Seven days after injection the effect of sodium hyaluronate was evaluated by bladder capacity measurement. Furthermore, the epithelial defective region of the mucosal membrane and bladder dry weight were determined and the condition of the epithelial membrane and extent of fibrosis were examined histologically. RESULTS: In all sodium hyaluronate treated groups a significant improvement in bladder capacity was observed compared to controls. In addition, a significant reduction was noted in the area of the epithelial defective region in the groups treated with 0.2% or 0.4% sodium hyaluronate and a significant decrease was noted in bladder dry weight in the group treated with 0.4% sodium hyaluronate. Histological examination revealed accelerated epithelial healing of the vesical mucosa and inhibited vesical fibrosis in the group treated with 0.4% sodium hyaluronate. CONCLUSIONS: Our findings suggest that sodium hyaluronate is effective for promoting epithelial healing of the vesical mucosa and inhibiting vesical fibrosis.     

Heat shock treatment increases engraftment of transplanted human myoblasts into immunodeficient mice

Myoblast transfer therapy (MTT) is a strategy that has been proposed to treat some striated muscle pathologies. However, the first therapeutic trials using this technique were unsuccessful due to the limited migration and early cell death of the injected myoblasts. Various strategies have been considered to increase myoblast survival in the host muscle after MTT. Overexpression of heat shock proteins (HSPs) in mouse myoblasts has been shown to improve cell resistance against apoptosis in vitro and in vivo. Our objective was to determine whether heat shock (HS) treatment increased the survival of human myoblasts leading to better participation of the injected cells in muscle regeneration. For this study, HS-treated human myoblasts were injected into the tibialis anterior (TA) muscles of immunodeficient RAG-/- gammaC-/- mice. TA muscles were excised at 24 hour and at 1 month after injection. Our results showed that HS treatment increased the expression of the hsp70 protein and protected the cells from apoptosis in vitro. HS treatment dramatically increased the number of human fibers present at 1 month after injection when compared with nontreated cells. Interestingly, HS treatment decreased apoptosis at 24 hour after human myoblast injection, but no differences were observed concerning proliferation, suggesting that the increased fiber formation among the HS-treated group was probably due to decreased cell death. These data suggested that HS treatment might be used in the clinical context to improve the success of MTT.     

Innate inflammatory cells are not responsible for early death of donor myoblasts after myoblast transfer therapy

BACKGROUND: Myoblast transfer therapy (MTT) is a cell-based gene therapy representing a potential treatment for Duchenne muscular dystrophy. The rapid disappearance of donor myoblasts from transplanted muscles after MTT is one of the most controversial and significant obstacles facing research in this area. Dystrophin-deficient muscles show constitutively high levels of inflammation, thus necessitating an examination of whether inflammatory cells, specifically natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages, within dystrophic muscle are responsible for poor graft survival. METHODS: Female mdx mice were treated with RB6-8C5 monoclonal antibody, PK136 monoclonal antibody, or clodronate liposomes to systemically deplete neutrophils, NK cells, and macrophages, respectively. After each depletion regimen, the mice and age-matched controls received 5.0 x 10 male myoblasts injected longitudinally into each tibialis anterior muscle. Donor myoblast survival was assessed by Y-chromosome specific quantitative real-time polymerase chain reaction analysis. RESULTS.: The systemic depletion of host neutrophils and NK cells resulted in a transient improvement in donor myoblast survival at 72 hr and 7 days post-MTT, respectively. Systemic depletion of macrophages had no significant beneficial effect on myoblast survival. Overall, the number of detectable male donor myoblasts was similar at time 0 and 1 hr post-MTT; however, there was significant loss by 24 hr (approximately 50%-70%) followed by a continual decline in donor cell numbers. CONCLUSIONS: Neutrophils and macrophages do not seem to play a major role in the rapid death of donor myoblasts after transplantation into dystrophic muscle. NK cells similarly seem to have no significant effect, contrary to earlier findings reported by our group.     

成肌细胞的临床应用现状及前景

目的 介绍成肌细胞在临床常见疾病细胞治疗和基因治疗中的研究现状、前景和存在的问题。方法 查阅国内外近15年来对Duchenne型肌营养不良、帕金森病、脊髓疾病、永久性面瘫、心血管系统疾病、骨、关节及肌肉损伤、血液系统疾病以及垂体性侏儒等的细胞治疗及基因治疗文献，并进行综合分析。结果 成肌细胞移植是治疗多种常见疾病较为理想的方法，在医学领域中的应用取得了一定进展，但也存在免疫排斥及成肌细胞移植最佳载体的选择等问题。结论 利用成肌细胞为载体携带外源基因，治疗临床常见疾病是目前研究的重点和热点，存在的主要问题是移植免疫、成肌细胞融合率以及目标蛋白的表达。成肌细胞来源和取材容易，易于在体外培养，便于回输给宿主，这些优点利于其在临床诸多领域的中应用。     

Exposure to tissue culture conditions can adversely affect myoblast behavior in vivo in whole muscle grafts: implications for myoblast transfer therapy

The effects of tissue culture conditions on the viability of myoblasts in whole muscles transplanted in vivo were investigated. Whole male (SJL/J) donor muscles were exposed to various tissue culture reagents and proteolytic enzymes, and allografted into female (SJL/J) host mice. Desmin immunohistochemistry was used to assess the numbers of myogenic cells (as an index of myoblast viability and the extent of regeneration) in tissue sections of whole-muscle grafts sampled on days 7 and 14. DNA quantitation with a Y-chromosome-specific probe was used to determine the total Y-1 sequence DNA (as an index of myoblast survival and proliferation) in whole-muscle grafts sampled on days 1, 3, and 7. In grafts exposed to serum-free medium, there was a delay in myoblast fusion at 7 days that was recovered by 14 days, but exposure to serum (10% or 20%) had a prolonged adverse effect on myotube formation at 14 days. DNA quantitation demonstrated that either serum-free culture medium or 10% serum enhanced the number of male cells within whole-muscle grafts at 7 days. Proteolytic digestion (even for 5 min) of whole muscles prior to grafting was extremely detrimental to myoblast survival and viability at 7 and 14 days. The unexpected finding of adverse effects of tissue culture conditions on the regeneration of whole-muscle grafts in vivo appears to parallel the major problem of the rapid death of isolated cultured donor myoblasts after injection in myoblast transfer therapy. The use of whole-muscle grafts provides an alternative and sensitive model to analyze the crucial effects of various tissue culture components on the subsequent survival and proliferation of myogenic cells in vivo.     

膝关节手术后注射透明质酸钠效果观察

目的　探讨膝关节术后关节腔内注射透明质酸钠的效果。方法　 1998年 1月～ 2 0 0 1年 2月 ,对关节镜手术 134例于手术结束时 ,以及膝关节开放手术 91例于术后 2 4小时拔引流管时 ,分别在关节腔内注射透明质酸钠 4ml(用药组 ) ;术后第 5天抽出关节积液 ,再注入透明质酸钠注射液 2 ml;每周 1次 ,连续 5周为一个疗程 ,根据病情注射 1～ 2个疗程 ,观察各时间点疼痛 VAS评分和达到最大无痛活动度的时间。与同期手术未用药的 85例进行比较。结果　用药组术后各时间点的疼痛程度评分均低于未用药组 ,关节镜手术用药组术后达最大无痛活动度所需的时间为 3天 ,未用药组为 5天 ;膝关节开放手术用药组达最大无痛活动度的时间为 6天 ,未用药组为 9天。结论　膝关节手术后关节腔内注射透明质酸钠能有效止痛 ,并有助于关节功能恢复     

透明质酸钠预防屈肌腱粘连的临床研究

目的　评价透明质酸钠预防术后屈肌腱粘连的临床效果。方法　 1998年～ 1999年对 47例屈肌腱手术者 ,于肌腱损伤修复部鞘内或局部分别注入两种透明质酸钠凝胶制剂。 A组注入透明质酸钠 I号 ,2 0 m g/ 2 ml,17例 ;B组注入透明质酸钠 号 ,2 0 mg/ 2 ml,16例 ;C组除不用透明质酸钠外 ,其它治疗与 A、B组相同 ,14例。于术后 1、2和 3个月测定相关部位的功能、疼痛和肿胀等情况 ,按关节功能和握拳功能评价透明质酸钠预防粘连的效果。结果　 47例经 1～ 3个月随访 ,A组优良率为 6 4.71% ,B组为 6 8.75 % ,C组为 42 .86 % ,A及 B组与 C组比较有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;各组均未见明显毒副作用。结论　两种透明质酸钠凝胶均有明显抑制术后屈肌腱粘连形成的作用 ,且使用安全方便