重组内切几丁质酶的纯化及其催化壳聚糖降解的研究

目的:研究重组内切几丁质酶的分离纯化及其催化壳聚糖制备壳寡糖的反应条件优化。方法:重组菌发酵液经PEG20000浓缩和DEAE-Sepharose FF离子交换层析后,测定总蛋白含量和内切几丁质酶活力。用纯化的内切几丁质酶催化壳聚糖制备壳寡糖,探讨其最佳的反应条件。结果:纯化的内切几丁质酶比活力41.34U/mg,纯化倍数2.49,酶总回收率89.63%。内切几丁质酶催化壳聚糖降解制备壳寡糖的最优化反应条件是:壳聚糖质量分数4%,p H7.0,温度30℃,时间12 h。结论:本研究结果为内切几丁质酶和壳寡糖的产业化应用奠定了良好基础。     

酶法降解壳聚糖及壳寡糖的初步研究

利用Mitsuaria sp.141-2发酵所得的粗酶液降解壳聚糖,研究了反应时间、底物浓度、pH、温度、加酶量、脱乙酰度对酶促反应的影响。结果表明,该酶降解壳聚糖的最适条件为:底物浓度3%,pH 5.2～5.6,温度65℃,加酶量7 U/g壳聚糖。利用薄层层析法对酶解产物进行分析,酶解产物大部分为三糖和四糖,单糖的含量随酶解时间延长而逐步增多。酶解3 h后可得到平均聚合度小于10的壳寡糖混合物。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

纤维素酶法制备壳寡糖工艺的研究

以虾壳壳聚糖为原料,纤维素酶为催化剂制备壳寡糖,探讨了纤维素酶添加量、酶解温度、溶液pH值及酶解时间对壳寡糖得率的影响。通过单因素和正交实验确定酶解最优条件为:纤维素酶添加量1.2g/dL、酶解温度50℃、溶液pH值4.5、酶解时间10h,此条件下壳寡糖得率达到32.15μg/mL;各因素对壳寡糖得率的影响依次为酶解温度>酶解时间>溶液pH值>纤维素酶添加量。     

新食品原料壳寡糖的酶法生产研究

目的针对高分子原料壳聚糖在食品工业应用中的两大难题——清洁生产与安全食用,研究了内切壳聚糖酶EC.3.2.1.132在新食品原料壳寡糖工业生产中的应用。方法通过广泛筛查,选育产酶活性高、性能稳定、具有单一内切模式的野生菌种。综合应用生物工程技术构建高效表达的基因重组工程菌,经优化发酵条件、建立简易纯化方法,获得了专一性内切壳聚糖酶。采用循环型清洁生产工艺用于新食品原料壳寡糖的工业化生产。结果从产酶量10 U/mL左右的野生型曲霉菌株Jxsd-01获得成熟基因,构建重组毕赤酵母工程菌表达体系,内切壳聚糖酶蛋白产量达到0.95 g/L。采用循环型清洁生产工艺酶法生产的壳寡糖含量高达98%,聚合度n=2~10,原料转化率95%以上,生产过程中无废水、废渣产生。结论内切壳聚糖酶应用于食品工业,实现新食品原料壳寡糖的工业化酶法生产,达到清洁、安全、高效的效果,具有应用推广的价值。     

组成型壳聚糖酶制备壳寡糖酶解条件的优化

主要对组成型壳聚糖酶降解壳聚糖制备低壳寡糖的工艺进行了研究。以酶解产物壳寡糖的产量(mg)为指标,酶解pH、酶解温度(℃)、底物浓度(%)、酶解时间(min)为自变量,在单因素试验的基础上,通过正交实验确定了最佳酶解工艺为:酶解pH 7.0、酶解温度50℃、酶解时间90 min、底物浓度1%,此时壳寡糖产含量为5.476 mg。     

毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

优化并全合成解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）壳聚糖酶编码基因并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现分泌表达,表达产物的蛋白质量浓度达到0.23 mg/mL。壳聚糖水解酶的最适pH值为5.0,最适温度为45 ℃,比活力达52.2 U/mL。该酶在50 ℃以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物进行了组成及结构分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度3～15、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振鉴定结果显示,壳寡糖组分的还原末端及非还原末端均主要由氨基葡萄糖组成。综上,本研究高效表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶,并制备了确定末端结构的壳寡糖,为壳寡糖的结构与功能关系研究提供理论支持。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

真菌壳聚糖酶研究进展

壳聚糖酶是专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶。在对比分析真菌壳聚糖酶和细菌壳聚糖酶的异同的基础上,总结近年来真菌壳聚糖酶在分类、酶学性质、基于分子生物学和生化工程的高产策略的研究进展。通过整理文献发现,来自真核微生物的壳聚糖酶降解产物为壳寡糖与氨基葡萄糖,具有分子质量大、活性较低等特点,针对酶活低这个迫切要解决的问题,讨论了提高产酶的潜在策略。     

用于壳聚糖降解的复合酶制剂产生菌的筛选

以壳聚糖为唯一碳源,结合固态培养基发酵培养,从自然界中筛选得到一株产复合酶的菌株,初步鉴定为曲霉属.该菌产复合酶中以壳聚糖酶、纤维素酶和α-淀粉酶为主,它们的酶活分别为2.206、0.790、3.229U/mL.该复合酶降解壳聚糖的最适温度为50℃,最适pH为5.6,最适时间为4h.通过有机溶剂分级沉淀,发现该复合酶降解壳聚糖的最终产物以聚合度为8～16的壳寡糖为主,表明该复合酶在壳寡糖制备方面具有一定的应用价值.     

酶法制备壳寡糖及其抗肿瘤活性评价

为进一步分析壳寡糖抗肿瘤活性及其机制,采用酶法制备工艺获取组分清晰的壳寡糖,优化酶解条件为酶解时间4 h、加酶量120 U/g,结合乙醇沉淀、超滤和纳滤联用的工艺获得聚合度2～4的壳寡糖。比较评价壳寡糖及其与阿霉素联用对3种肿瘤细胞的抑制效果,其中作用最为明显的人乳腺癌MDA-MB-231的细胞生存率降低20%。利用细胞迁移实验和激光共聚焦分析机制,得出壳寡糖可抑制MDA-MB-231细胞迁移并促进阿霉素入核。由此说明,壳寡糖可增强MDA-MB-231细胞对阿霉素的敏感性。     

MTT法测定甲壳低聚糖对肠道微生物生长的影响

以肠道益生菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)和肠道腐败菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)为研究对象,通过用MTT法来考察甲壳低聚糖对肠道微生物生长的影响。结果表明:在一定质量浓度(0.1～0.8g/100mL)范围内,甲壳低聚糖对肠道益生菌保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌均有明显的增殖作用;随着菌体培养基糖(甲壳低聚糖)质量浓度的增大,甲壳低聚糖对肠道腐败菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌抑制效果增强;同时分子质量1kD的甲壳低聚糖比分子质量3kD的对微生物生长的影响更为显著。     

分子动力学模拟研究壳寡糖与脂肪酶相互作用机制

壳聚糖及其衍生物在酶固定化领域有着广泛的应用。了解酶与壳聚糖衍生物在分子水平上的相互作用机制,对相关生物催化剂的设计和应用具有重要意义。本研究采用分子动力学模拟方法研究南极假丝酵母脂肪酶B(Ca LB)与壳寡糖(OCTS)的相互作用,并对脂肪酶与催化底物进行分子对接研究脂肪酶催化活性中心和底物结合构象和结合亲和力。结果表明,脂肪酶与OCTS之间的静电和L-J相互作用在自组装过程的初始阶段起着重要的作用。模拟过程结束后,Ca LB-OCTS组装体共包含14个OCTS分子和1个Ca LB分子。Ca LB与OCTS之间存在静电相互作用和氢键相互作用,在模拟过程中,L-J势能和库仑势能分别降低了约1480 kJ/mol和2324.0k J/mol,两者间的平均氢键数从0增加到约17,Ca LB与OCTS的可及面积均因为相互作用而降低了20nm~2。二级结构表明,与游离酶对照相比,Ca LB-OCTS的β折叠含量从9.78%增加至12.62%,无规卷曲loop从49.21%下降至46.50%,Ca LB-OCTS的β折叠的含量更高,而无规卷曲含量更低。此外,Ca LB-OCTS保留了其原有的蛋白骨架结构以及活性位点口袋的构象。     

壳聚糖及其衍生物的抗氧化作用

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法和DPPH法,研究5种壳聚糖及其衍生物——壳聚糖(chitosan)、壳寡糖(ol-igo-chitosan)、羧甲基壳聚糖(CM-chitosan)、N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)、氨基葡萄糖盐酸盐(GlcNH2.HCl)的体外清除羟自由基和DPPH.自由基的能力。结果表明:在实验设置的浓度范围内,对羟自由基的清除能力依次为oligo-chitosan>chitosan>GLcNAc>GlcNH2.HCl>CM-Chitosan,且其清除能力随着浓度的增加而增加。其中2 mg/mL的Oligo-chitosan对羟自由基的清除率最大达到97.81%,相当于4 mmol/L的VC对羟自由基的清除能力。对DPPH.的清除能力大小依次为oligo-chitosan>chitosan>GlcNH2.HCl≥GLcNAc>CM-chitosan,且其清除能力随着浓度的增加而增加。2 mg/mL oligo-chitosan的清除率为97.34%,大于6mmol/L VC的清除速率79.92%。2种方法测定的结果比较一致。     

Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides

Chitosan and its oligosaccharides, which are known to possess multiple functional properties, have attracted considerable interest due to their biological activities and potential applications in the food, pharmaceutical, agricultural and environmental industries. Many researchers have focused on chitosan as a potential source of bioactive materials in the past few decades. This review focuses on the biological activities of chitosan and chitooligosaccharides based on our and others’ latest research results, including hypocholesterolemic, antimicrobial, immunostimulating, antitumor and anticancer effects, accelerating calcium and iron absorption, anti-inflammatory, antioxidant and Angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory activities and so on, which are all correlated with their structures and physicochemical properties. The bioactivities summarized here may provide novel insights into the functions of chitosan, its derivatives or oligosaccharides and potentially enable their use as functional-food components and additives.     

OPTIMIZATION OF IMMOBILIZATION PROCESS ON CRAB SHELL CHITOSAN AND ITS APPLICATION IN FOOD PROCESSING

Optimization of immobilization process on crab shell chitosan was carried out. The chitosan purified from the crab shell was used as the matrix for the immobilization of α-galactosidase. The prepared matrix was activated with glutaraldehyde at different concentrations and different time intervals and coupling time was determined. Immobilization of α-galactosidase on crab shell chitosan resulted in 72% immobilization yield. The parameters like the effect of pH, temperature, thermal stability and storage stability were determined. The study revealed that immobilized enzyme shows better thermal and storage stability than the free enzyme. The performance of the free and immobilized α-galactosidase was tested in continuous stirred batch reactor to hydrolyze raffinose family oligosaccharides in soymilk. The oligosaccharide content of the soymilk was reduced by 77% in continuous reaction by immobilized α-galactosidase.

PRACTICAL APPLICATIONS

Chitosan used for the immobilization of α-galactosidase offers several advantages for enzyme immobilization and it contains all characteristic features for use as industrial material. Immobilization of one of the industrial important enzyme α-galactosidase, as it has many potential application in hydrolyzing raffinose series of oligosaccharides. The hydrolyzed soymilk after processing by immobilized α-galactosidase is free from flatus-inducing factors like raffinose and stachyose. It can be used as an alternative means for cow's milk for lactose intolerance, particularly among individuals in developing countries. As chitosan used is from the crustacean waste from the crab shell, the production and utilization of chitosan provides an economical alternative means of crustacean shell waste disposal sought worldwide.     

Purification and characterization of a 49-kDa chitinase from Streptomyces griseus HUT 6037

A 49-kDa chitinase (pI7.3) was purified to homogeneity from the culture supernatant of Streptomyces griseus HUT 6037 by ultrafiltration, DEAE-Sephadex A-50 and Sephadex G-100 column chromatographies, and chromatofocusing. The purified enzyme was stable up to 40 degrees C. The N-terminal amino acid sequence of the enzyme was highly homologous to the N-terminal region of the fibronectin type III-like domain of S. olivaceoviridis chitinase 01 belonging to family 18 glycosyl hydrolases. The 49-kDa chitinase hydrolyzed partially N-acetylated chitosan more easily than colloidal chitin. The hydrolyzate of 54% deacetylated chitosan by the enzyme was separated by CM-Sephadex C-25 column chromatography. The structures of the oligosaccharides obtained were determined by MALDI-TOF MS analysis combined with exo-glycosidase digestion. In addition to GlcNAc, (GlcNAc)2, and (GlcNAc)3, hetero-chitooligosaccharides with GlcNAc at the reducing end were detected. Thus, the specificity of the enzyme for the hydrolysis of the beta-1,4-glycosidic linkages in partially N-acetylated chitosan was similar to that of the family 18 chitinases.     

过氧化氢制备壳寡糖的工艺

为了简便高效的制备出壳寡糖,采用过氧化氢(质量分数1.0%)来降解稀醋酸溶液(质量分数1.0%)中含量为3.5%的壳聚糖,60℃下摇床反应4.5h后得到壳寡糖水溶液,检测溶液中还原性端基数并估算降解物平均聚合度来表征降解程度。降解液浓缩到25%,调pH7.0,用体积分数95%乙醇分级沉淀分离壳寡糖可以除掉部分单糖,总的回收率达93.0%。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析,3倍醇沉出的产物为2-4糖为主的壳寡糖产品。实验说明过氧化氢氧化降解壳聚糖可制取聚合度为2-4的壳寡糖。     

微波强化壳聚糖固相酸降解研究

本文研究了微波强化下的壳聚糖固相酸降解反应,分析了降解过程中微波辐射功率和盐酸用量等参数对降解产物分子量变化的影响,并利用红外光谱和核磁共振氢谱对降解产物的结构进行了表征.研究表明,微波辐射功率和盐酸用量的增加均有利于壳聚糖分子量的降低.采用微波辐射壳聚糖固相酸化物料15 min,即可获得重均分子量低于50000的低分...     

响应面法优化组成型壳聚糖酶酶解条件

以壳聚糖为原料,通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）发酵所得壳聚糖酶水解壳聚糖产生壳寡糖,对酶解pH、温度、底物浓度和时间分别进行单因素试验,并在此基础上,通过响应面法研究这4种因素对壳寡糖产量的影响,优化酶解条件。结果表明,壳聚糖酶酶解的最佳条件为pH值5.6,酶解温度53 ℃,壳聚糖质量分数2.09%,酶解时间157 min。在该优化条件下,壳寡糖的浓度为35.73 μmol/mL,与模型预测值35.476 μmol/mL接近,则该模型可用于优化壳聚糖酶酶解条件。