人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

Survivin基因真核表达载体的构建及鉴定

  目地 构建pcDNA3.1-Survivin基因的真核表达载体并鉴定。方法 提取大鼠肝细胞总RNA,RT-PCR 法扩增Survivin cDNA 片段, 双酶切构建pcDNA3.1-Survivin, 重组载体。结果 重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Survivin。     

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.