HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立及其初步研究

为探讨汉滩病毒核衣壳蛋白 (HTNV NP )诱生的特异性细胞免疫的分子基础 ,为阐明HFRS的发病机制和疫苗的设计提供资料 ,本文分离HFRS患者的PBMC ,建立HTNV NP特异性的CTL克隆 ,同时将克隆有HTNVS基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系 (BLCL ) ,建立CTL靶细胞系 ,并进行细胞杀伤试验。建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应 ,平均杀伤率分别为 5 0 2 %、 39 0 %和 2 5 8%。表明HTNV NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端     

我国疫区HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立

目的：探讨汉滩病毒核衣壳蛋白（HTNV-NP）诱生的特异性细胞免疫的分子基础，阐明HFRS的发病机理。方法：分离HFRS患者的PBMC，建立HTNV-NP特异性的CTL克隆，同时将克隆有HINV S基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系（BLCL），建立CTL靶细胞系，并进行细胞杀伤试验。结果：建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应，平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%。结论：NTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端。     

汉滩病毒核蛋白T细胞表位的鉴定及其特异性T细胞应答规律的初步探讨

目的:鉴定引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒核蛋白(HTNV-NP)的T细胞表位,并探讨其特异性T细胞应答的规律。方法:合成覆盖HTNV-NP全长序列的全套部份重叠15肽,用ELISPOT方法筛选能刺激HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的15肽,并测定其特异性T细胞的频率。结果:47例HFRS患者中,有18例可对HTNV-NP产生特异性T细胞应答,并发现在病程的早期就已开始产生T细胞应答。从11例患者PBMC中,鉴定出了17种HTNV-NP特异的T细胞表位,其中14种T细胞表位为首次报道,T细胞表位主要位于NP一级结构的中部。结论:HFRS病程早期即可产生特异性T细胞应答,T细胞表位主要位于NP序列的中部,T细胞应答可能在汉滩病毒感染过程中起重要的免疫保护作用。     

汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定

目的　鉴定汉滩病毒核衣壳蛋白 (HTNVNP)C 端T细胞表位 ,为肾综合征出血热(HFRS)发病机理、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究奠定基础。方法　采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS恢复期患者外周血单个核细胞 (PBMC)。用IFN γELISPOT实验和T细胞增殖实验 ,测试 7名患者PBMC对 2 3条NPC 端合成多肽的T细胞应答。结果　IFN γELISPOT实验结果表明 ,2名供体(3、4 )可分别检测到对 5 1、70号 2条多肽特异性T细胞应答。在供体 3,70号肽特异性T细胞频率为4 5SFC 10 6 PBMC ;在供体 4 ,5 1号肽特异性T细胞频率为 82SFC 10 6 PBMC。T细胞增殖实验与ELISPOT结果基本一致 ,但 5 3号肽和 6 4号肽还可分别刺激供体 1和供体 4的T细胞增殖 ,而未能诱导IFN γ分泌。结论　 5 1号和 70号多肽可能是NPC 端较强的T细胞表位。     

汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价

目的：研究汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白G1与核蛋白（NP）部分片段在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学特性，为HTNV基因工程疫苗的研制提供依据。方法：构建含有HTNV G1S0.7嵌合基因的重组杆状病毒Bac-G1S0.7，用其感染的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠。用间接免疫荧光法、ELISA法、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验对被免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果：Bac-G1S0.7感染的昆虫细胞免疫小鼠后，测得免疫鼠血清抗HTNV抗体滴度最高达1：3200，含有特异性抗HTNV NP及抗HTNV糖蛋白G1的抗体，被免疫小鼠中有部分产生了较低滴度的中和抗体，免疫鼠脾细胞对HTNVNP或糖蛋白的增殖反应指数均高于阴性对照组。结论：G1S.07嵌合基因的昆虫细胞表达产物具有较好的免疫原性，可刺激机体同时产生针对HTNV NP与囊膜糖蛋白G1的细胞及体液免疫应答。     

汉滩病毒囊膜蛋白及核壳蛋白与免疫保护力的关系

目的 为了阐明汉滩病毒囊膜蛋白及核壳蛋白与免疫保护力的关系。方法 采用区带离心及柱层析纯化汉滩病毒LR1株囊膜蛋白（GP）和核壳蛋白（NP）,以GP、NP和GP＋NP分别免疫家兔,测定其中和抗体和保护力。结果 实验显示,GP和GP＋NP免疫组家兔血清中和抗体滴度≥1：10,NP免疫组家兔血清中和抗体≤1:5;而保护性试验显示,GP、NP、GP＋NP免疫组家兔均可保护100ID50同株病毒的攻击。结论 上述结果表明,汉滩病毒GP和NP组份均与其保护力有关。     

汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保 …

目的 建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型。以进行ｍＡｂ的保护实验。方法 将７～８ｗｋＢａｌｂ／ｃ小鼠于感染病毒前１ｄ及感染后１ｄ，２ｄ和４ｄ，分别经腹腔注环磷酰胺６５ｍｇ／ｋｇ体重，总剂量为２６０ｍｇ／ｋｇ体重，观察其发病及死亡情况。并检测其体内不同脏器中汉滩病毒抗原的分布及滴度。用ｍＡｂ对上述感染小鼠进行保护实验。结果 经环磷酰胺处理的成龄鼠，由汉滩病毒隐性感染变为急性染的乳鼠类似，平均发病与死亡时间     

胶体金免疫电镜技术鉴定一株抗HFRS病毒囊膜糖蛋白和核蛋白双特异性McAb

采用超薄切片和胶体金免疫电镜技术鉴定抗HFRS病毒McAb 3G1,结果发现其既对成熟病毒颗粒和囊膜颗粒标记阳性,又对颗粒状包涵体及丝状颗粒包含体标记阳性,从而提示该株McAb可能具有HFRS病毒囊膜糖蛋白和核蛋白双特异性。     

卵清白蛋白特异性T细胞克隆的建立及T细胞受体使用情况分析

目的：体外建立可长期培养的抗原特异性T细胞系及克隆，并分析其T细胞受体的使用情况。方法：用卵清白蛋白（OVA）免疫BALB／c小鼠，取淋巴结细胞在体外用抗原原复刺激建立抗原特异性T细胞系，通过能限稀释法进行克隆，应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体的应用。结果：建立了H－2^d限制的OVA特异性T细胞系，获得了3株特异性较高的T细胞克隆，T细胞系中TCR AV11S4和BV4S1应用频率最高，3株T细胞克隆的TCR均为AV5S2和BV2S1，这些T细胞所使用的TCRα链和β链在CDR3区有明显的共性，结论：获得了卵清白蛋白特异的T细胞系和克隆，且其T细胞受体的应用有一定的限制性。     

肾综合征出血热病人恢复期血清对汉滩病毒感染体外培养神经元的保护作用

目的用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元，感染汉滩病毒后，加入肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人恢复期血清，观察病毒感染神经元后细胞的变化以及ＨＦＲＳ病人恢复期血清对神经元的保护作用。方法将病毒感染的神经元加入不同浓度的ＨＦＲＳ病人恢复期血清（同时设立阴性血清对照组及正常细胞对照组和感染病毒对照组），使用ＭＴＴ比色试验检测神经元存活情况。结果各组神经元活性的ＭＴＴ比色试验显示，病毒感染组与未感染对照组比较差异有非常显著性（Ｐ＜０．００１），阴性血清对照组与正常细胞对照组比较，差异也有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。ＨＦＲＳ病人恢复期血清保护组与阴性血清对照组各小组间比较差异也都有非常显著性（Ｐ＜０．００１）。结论ＨＦＲＳ病人恢复期血清具有一定的中和病毒保护培养的神经元作用     

免疫酶斑点法检测汉坦病毒抗原的研究

目的 建立一种新的诊断肾综合征出血热(HFRS)的实验手段。方法 采用R22株、陈株和湖北株3种汉坦病毒接种家兔，制备兔抗汉坦病毒多克隆抗体(抗HTV-IgG)。然后采用混合的3种抗体进行免疫酶斑点法实验(IEDA)，检测患者血清和尿液中的汉坦病毒抗原。同时采用间接免疫荧光法(IFA)检测患者血清中抗汉坦病毒-IgM作对照。结果 经用相关分析，IEDA与IFA检测的结果高度相关。血中汉坦病毒抗原检出率为73．68％，尿中为65．00％。发病5d内，血中检出率为94．34％，尿中检出率为83．33％。5病日内的早期诊断率前者明显高于后者。结论 IEDA与IFA相比，阳性率比后者有较大提高，特别是5病日内的早期阳性率的提高明显，值得用于临床HFRS的早期诊断。     

Serum thrombospondin-1 is altered in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome

Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) is a severe acute viral disease with pathological changes of impaired capillary and small vessels and thrombocytopenia. In this study, serum thrombospondin (TSP)-1 concentration in patients with HFRS was determined to explore its possible role in the pathogenesis of HFRS. The concentration of TSP-1 was measured using a competitive enzyme-linked immunoabsorbent assay. Significantly decreased levels of serum TSP-1 were observed in HFRS patients at febrile and hypotensive phases compared with those in the controls. The serum levels of TSP-1 in HFRS patients with more severe clinical types was reduced more profoundly than those in patients with milder clinical types at febrile and hypotensive phases, although the differences in TSP-1 were not significant. It was indicated that insufficient production or increased consumption of TSP-1, or both of these, may contribute to the impairment of capillary and small vessels and the development of hypotension at the early stage of HFRS, and the decreased degree may be associated with disease severity.     

Study on the Cytotoxic T Lymphocytes Clone Specific for the Nucleocapsid Protein of Hantaan Virus from Peripheral Blood in Patients with Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome

Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) occursmainly in China with a high mortality rate and threatensthe health and life of population, Hantaan virus (HTNV),the prototype member of Hantavirus (HV) genus, causesHFRS in human. In the structural proteins of HV, the nu cleocapsid protein (NP), is associated with the functionsof viral RNA, and is also an important immunogen involv ing in the protective immune responses against infection.The pathogenesis of Hantaan virus infecti…     

用重组汉坦病毒NP、GP检测急性期HFRS患者血清中特异性IgG、IgM、IgA抗体

目的 探讨肾综合征出血热(HFRS)患者急性期IgA、IgG、IgM抗体的变化规律。方法 使用套式RT-PCR检测此次病毒感染情况。用杆状病毒表达的汉坦病毒重组核蛋白(rNP)和糖蛋白(rGP)为抗原，使用ELISA方法检测了14例急性期肾综合征出血热患者的6l份系列血清中的IgA、IgG、IgM抗体。结果 14例肾综合征出血热患者中，ll例患者的血清用RT-PCR检出家鼠型汉坦病毒核酸。几乎所有肾综合征出血热患者早期即有IgA、IgM、IgG抗体的迅速升高，抗rNP抗体滴度明显高于rGP。3种抗rNP抗体中早期IgG上升趋势最为显著，IgM与IgA次之，IgM与IgA上升趋势相近，但IgA的滴度明显高于IgM。抗rGP抗体中XgA变化最显著，IgG次之。IgM发病2周内总的变化趋势不明显，但是发病l周内滴度上升趋势明显，而发病第2周内则呈下降趋势。其中l例RT-PCR阳性的患者，早期IgM未测出，IgA的滴度却较高。l例重度患者，抗糖蛋白IgG、IgM和IgA抗体滴度均低于其他患者，且整个急性期一直维持较低水平。结论 肾综合征出血热急性期IgA、IgG、lgM变化具有明显的规律，抗糖蛋白和核蛋白抗体病患规律不同，检测IgM的同时检测IgA，可以提高诊断的准确性。     

Ⅰ型出血热患者中性粒细胞与淋巴细胞功能变化研究

目的研究肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系，进一步阐明发病机理。方法采用Ｅａ、Ｅｔ花环形成、ＰＨＡ皮肤试验及中性粒细胞趋化、吞噬、ＮＢＴ还原等多种试验方法同时对３２例由Ｈａｎｔａａｎ病毒引起的姬鼠型ＨＦＲＳ患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系进行动态测定。结果ＨＦＲＳ患者早期前五项指标均明显低于正常人（Ｐ＜０．０１）；病程中，淋巴细胞损伤程度较粒细胞更加突出；中性粒细胞ＮＢＴ还原能力在恢复期反降至最低（Ｐ＜０．０５）。此外，患者这两种细胞的免疫功能在恢复期并未能完全达到正常水平。结论ＨＦＲＳ患者淋巴细胞免疫功能损伤程度与病程密切相关，可能是Ｈａｎｔａａｎ病毒直接作用的结果；而中性粒细胞免疫功能变化比较复杂，有待进一步研究。恢复期患者细胞免疫功能未能完全恢复提示临床治疗应予以关注。     

应用免疫金银直接染色法诊断肾综合征出血热

应用免疫金银直接染色法（Ｄ－ＩＧＳＳ）对肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞进行ＨＦＲＳＶ抗原检测，发现Ｅ６细胞的胞浆和细胞膜上能清楚地观察到黑色均匀的银颗粒，而用ＨＦＲＳＶ免疫兔血清ＩｇＧ作阻断试验，却未见银颗粒。在此基础上对３２例ＨＦＲＳ患者检测外周血白细胞中的ＨＦＲＳＶ抗原，并和间接免疫荧光法（Ｉ－ＩＦＡ）进行对照，结果病程１０天以内Ｄ－ＩＧＳＳ法阳性率达到１０００％，个别病例病程２３天仍能检出ＨＦＲＳＶ抗原，而ＩＦＡ法在病程１１天以后阳性率明显下降，病程１４天后未检出ＨＦＲＳＶ抗原。说明Ｄ－ＩＧＳＳ法敏感性明显高于ＩＦＡ法。为对比外周静脉血和手指末稍血白细胞中ＨＦＲＳＶ抗原检出率，对３２例患者进行同步采血，结果ＨＦＲＳＶ抗原检出率无显著性差异（Ｐ＜００５）。我们认为Ｄ－ＩＧＳＳ法检测ＨＦＲＳ患者末稍血中的ＨＦＲＳＶ抗原，是简而易行的方法，可用于ＨＦＲＳ早期诊断。     

北京市肾综合征出血热聚集疫情分析

目的 描述分析北京市一起肾综合征出血热聚集性疫情,探讨低发病率地区聚集性疫情的流行病学特征.方法 2007-2014年肾综合征出血热病例数据来源于中国疾病预防控制信息系统中现住址为北京市的病例.疫情数据来源于流行病学调查和疫情防控记录.病例血清汉坦病毒抗原和抗体检测采用ELISA法.啮齿类动物使用夹夜法捕捉,其血清汉坦病毒抗原抗体使用间接免疫荧光方法检测.结果 2007-2014年北京市平均每年报告肾综合征出血热病例18例,年发病率在0.09/105-0.16/105.聚集疫情共涉及2名实验室确诊病例和1名无症状感染者.病例临床症状相对较轻,居住地灭鼠前鼠密度为10.0％,灭鼠后密度为1.3％.家鼠肺标本汉坦病毒抗体阳性率为12.5％(1/8),宠物鼠中未检出汉坦病毒.结论 北京市仍存在发生肾综合征出血热聚集疫情的可能,这起涉及3名感染者的疫情为“城中村”家鼠传播.