卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXR1、OV-189原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXRl、OV-189的原核表达载体.方法:用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK-CMV质粒中扩增FXRl、OV-189的CDS,双酶切后插入原核表达质粒pET-30b( ),经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功扩增了FXRl、OV-189的CDS,并构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,经测序,与Genbank中的相应序列一致,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达目的蛋白.结论:成功构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的克隆 表达及纯化

目的:克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,并进行原核表达及纯化.方法:从Caco-2细胞中提取总RNA,利用RT-PCR克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,然后将其连接到原核表达载体pET-32a.将构建成功的重组表达载体pET-32a-TG2导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达His-TG2融合蛋白.用Ni-NTA蛋白纯化柱对融合蛋白进行纯化,采用Western Blotting检测重组蛋白的特异性.结果:成功克隆出人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,构建了pET-32a-TG2原核表达载体,并成功诱导了重组融合蛋白His-TG2的表达.结论:构建了表达人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的原核表达系统,并成功对重组蛋白进行了纯化.     

人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达

目的: 利用基因技术克隆CD40L分子的胞外区184～831片断cDNA,构建其原核表达载体,从而建立原核表达体系. 方法: 采用RT-PCR 方法从人扁桃体的总RNA中扩增CD40L分子184～831片断的cDNA,以限制性酶切和DNA 测序进行鉴定,并将目的片断克隆至原核表达载体pET-28a ,让重组质粒在BL21中表达,利用Western blot鉴定目的蛋白. 结果: 克隆到人sCD40L分子184～831片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致;构建了该片断的原核表达载体, 且目的蛋白能在BL21中表达. 结论: 成功克隆人sCD40L分子184～831片断的cDNA并构建了其原核表达载体. 在BL21中成功表达了目的蛋白.     

登革病毒Ⅱ(NGC株)pET-42a-NS_(4b)-NS_5载体构建

目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得了一个长为1.05Kb的基因片段。结论:成功构建了含有DEN2全长NS4b-NS5基因的原核表达载体pET42a-NS4b-NS5。     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

含产气荚膜梭菌肠毒素基因重组质粒pET-28a-CPE的构建和表达

目的 构建含全长产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因的重组表达质粒pET-28a-CPE并进行原核表达.方法 培养并提取表达肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615的基因组DNA,PCR扩增出全长CPE基因片段并连接入pET-28a载体质粒中,构建重组原核表达质粒pET-28a-CPE,进行酶切及测序鉴定,并转化入感受态大肠杆菌(E.coli)BL21中,用IPTG诱导CPE表达.结果 复苏、培养成功产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615,成功构建了表达质粒pET-28a-CPE,经酶切及测序鉴定结果 与设计的完全相符,成功用E.coil BL21进行了原核表达,目的 蛋白CPE占总表达蛋白45.37%.结论 本实验成功构建并表达了含CPE的重组质粒pET-28a-CPE,为进一步观察CPE时前列腺肿瘤等的生物学作用奠定了基础.     

苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC-823细胞形态的影响

目的:克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC-823细胞的影响.方法:应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用 NTA-Ni2+ 树脂分离纯化所表达的 MAP30 融合蛋白,并经 SDS-PAGE 电泳鉴定;纯化的蛋白作用于 BGC-823 细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察. 结果:成功扩增出MAP30基因为861 bp, 与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建 pET-28a-MAP30原核表达重组质粒;通过NTA-Ni2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30 000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化.结论:成功构建pET-28a-MAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC-823细胞明显的形态学变化.     

卵巢上皮性癌SEREX抗原基因TM4SF1、C1D、TIZ原核表达载体的构建及表达

目的：克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因：TM4SF1、C1D、TIZ的原核表达载体。方法：用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK～CMV质粒中扩增TM4SF1、CID、TIZ的编码序列（coding sequence,CDS）,双酶切后插入原核表达质粒pET-30b（＋）,经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE分析表达产物。结果：成功扩增了TM4SF1、CID、TIZ的CDS,并构建了原核表达质粒pET30b（＋）／TM4SF1、pET-30b（＋）／C1D、pET-30b（＋）／TIZ,经测序与Genbank中的相应序列一致。并在大肠杆菌BI。21中成功诱导表达目的蛋白。结论：成功构建了原核表达质粒pET-30b（＋）／TM4sFl、pET-30b（＋）／C1D、pET-30b（＋）／TIZ,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

目的 构建耐辐射奇球菌(D．rdiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E．coli BL21(DE3)中表达。方法 用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a( )连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)。用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果 获得了D．radiodurans-Mn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E．coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51800u／g湿菌体。结论 成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D．radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础。     

人pcsk9基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体,优化pcsk9诱导表达条件。方法聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列。扩增产物经双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,分别在不同条件下对其进行诱导,获得pET-28b-pcsk9的最佳诱导表达条件。结果成功构建了pET-28b-pcsk9重组表达载体,其最佳表达条件为菌液光密度值取0.6,诱导温度取30℃,诱导剂终浓度取1.0 mmol/L,诱导时间取8 h。结论该重组表达载体构建成功,在大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中可有效地表达,对诱导所用的温度和时间相对比较敏感。     

人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达

目的构建人DNMT3B1原核表达载体,并进行初步表达。方法据Genebank中人DNMT 3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果 PCR扩增得到人DNMT 3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-DNMT3B1I,PTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中高效表达,相对分子质量约为100 kd。结论成功构建了人DNMT3B1原核表达载体并完成其在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

人DNMT3B7原核表达载体的构建和表达

目的:构建人类DNA甲基转移酶(DNMT)3B7原核表达载体,并进行初步表达。方法:根据Genebank中人DNMT3B7 cDNA序列设计并合成特异性引物;提取HCT116细胞总RNA并进行反转录,利用PCR技术扩增出DNMT3B7;将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定;然后将重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果:PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-4T.3-DNMT3B7;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示目的蛋白在E.coli BL21中高效表达,分子量约为40 kD。结论:成功构建了人DNMT3B7原核表达载体,完成了其在E.coli BL21中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子的融合与鉴定

目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,并构建原核表达载体,表达pd20-TNF-α融合蛋白.方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因,构建pd20-TNF-α原核表达载体,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot 检测分析.结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约21000处出现了1条新生的蛋白条带,转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达,为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础.     

人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达

目的：构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中表达canstatin重组蛋白。方法：用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA,通过RT—PCR扩增canstatin的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将canstatin cDNA定向克隆于原核表达载体pET30a( )中,而后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。结果：canstatin cDNA克隆人质粒pET30a( )获得了重组表达载体pET30a( )／Cans,canstatin的cDNA长度为684bp．编码227个氨基酸。IPTG诱导原核表达载体pET30a( )／Cans在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体总蛋白量的35％。结论：原核表达载体pET30a( )／hCans存大肠杆菌BL21中高效表达canstatin重组蛋白。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

小鼠周脂素基因的原核表达及纯化

目的构建小鼠周脂素（prilipin,Plin）原核表达载体,表达周脂素蛋白并进行初步纯化,为研究周脂素的功能奠定基础。方法通过酶切从pMD18-Plin重组载体上酶切下周脂素目的基因,定向插入原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果构建的pET-32a-Plin载体能够表达周脂素重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的50%,经初步纯化后,纯度达95%以上。结论成功构建了周脂素原核表达载体,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

肿瘤坏死因子-α转换酶基因金属蛋白酶区的克隆及表达

目的: 克隆和构建含有肿瘤坏死因子-α转换酶金属蛋白酶区(metallopro teinase dom ain of human tumor necrosis factor-αconve rting enzyme,TACEmp)基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达。方法: 用RT-PCR方法,从THP-1细胞中扩增出TACEmp基因片段,插入表达载体pET-DsbAmut,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果: 克隆TACEmp基因并构建重组表达载体pET-DsbAmut-TACEmp转化入BL21,IPTG诱导后获得高效表达的TACEmp融合表达蛋白。结论: 利用分子伴侣融合蛋白技术使TACEmp在原核表达系统中获得了高效可溶性表达。