TRPM及TRPV家族mRNA在大鼠生精细胞中的表达

目的 探讨瞬时受体电位M型(TRPM)及V型(TRPV)家族基因在大鼠牛精细胞中的表达.方法 采用机械法分离大鼠生精细胞,TRIzol法提取细胞总RNA,RT-PCR合成并扩增目的 基因,琼脂糖凝胶电泳检测目的 基因的存在,实时荧光定量RT-PCR技术检测目的 基因相对表达量.结果 在大鼠生精细胞中检测到TRPM3、TRPM4、TRPM7及TRPV5 mRNA的表达,未能检测到TRPM1、TRPM2、TRPM5、TRPM6、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4及TRPV6 mRNA的表达.实时荧光定量RT-PCR技术检测显示TRPM家族在大鼠睾丸生精细胞中的表达以TRPM7表达量最高,相当于内参β-actin的(0.0430±0.0034)%,TRPM3和TRPM4表达相对较弱,分别相当于TRPM7 56%和63%.大鼠睾丸生精细胞中TRPV家族仅存在TRPV5的表达,其表达量相当于内参β-actin的(O.0157±0.0029)%.结论 大鼠生精细胞中存在多种TRPM及TRPV家族基因的表达,其中TRPM4及TRPM7 mRNA在大鼠生精细胞中呈相对较高表达.本研究结果 将为研究生精细胞中TRP通道的功能及TRP通道各亚型之间的相互关系提供参考依据.     

BANF2基因在大鼠睾丸不同发育时期的表达及初步研究

目的 观察大鼠睾丸中BANF2基因在不同发育时期的表达,进而研究该基因在精子发生中可能起的作用.方法 取三组出生后2-65日龄总计21个时间点的Wistar雄性大鼠,从各时间点的睾丸组织中提取总mRNA和总蛋白,并用实时定量PCR、Western blot技术检测BANF2基因在大鼠精子发生过程的表达水平,免疫组化观察...     

经典瞬时感受器电位通道在炎性痛及神经病理性痛大鼠背根神经节表达水平的差异

目的 探讨背根神经节细胞经典瞬时感受器电位通道家族（TRPC）各亚型在炎性痛及神经病理性痛中表达是否存在差异性.方法 选用Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分为两大组：炎性痛组和神经病理性痛组.炎性痛组又随机分为：空白对照组,生理盐水对照组,蜜蜂毒炎性痛模型组;神经病理性痛组又随机分为：空白对照组,假手术组,坐骨神经分支选择性结扎模型组.测定各组大鼠机械刺激缩足反射阈值和热刺激缩足潜伏期;然后分别于蜜蜂毒处理后2h及神经结扎后1周,检测各组大鼠背根神经节细胞内TRPC家族各亚型mRNA表达水平和各组背根神经节细胞内TRPC家族相应亚型蛋白表达水平.结果 实时定量基因扩增荧光检测技术显示,背根神经节细胞TRPC3、4、5亚型的mRNA表达水平在蜜蜂毒炎性痛组显著增加（P＜0.001）;而在神经病理性痛组背根神经节细胞TRPC2 mRNA表达水平显著提高（P ＜0.001）,同时TRPC3 mRNA表达水平却显著降低（P＜0.05）.免疫组化结果显示蜜蜂毒炎性痛组大鼠背根神经节内TRPC3、4、5免疫阳性细胞数显著增加;而神经病理性痛组大鼠背根神经节内TRPC2免疫阳性细胞数显著增加.结论 蜜蜂毒炎性痛模型及坐骨神经分支选择性结扎模型大鼠背根神经节细胞TRPC通道各亚型基因及蛋白表达水平存在差异,提示TRPC通道各亚型在炎性痛及神经病理性痛的发病中可能发挥着不同的作用.     

Rab13 GTPase在大鼠睾丸中的表达及其与生精上皮周期的关系

目的 初步明确 Rab13 GTPase在大鼠精子发生及成熟过程中的表达情况和可能发挥的作用.方法 首先通过RT-PCR技术检测了Rab13 GTPase在不同日龄大鼠睾丸组织中的表达,又利用RT-PCR和Western-blot 检测了Rab13在大鼠不同组织中的表达情况,最后采用免疫组化技术检测Rab13 GTPase在大鼠不同期别生精上皮中的分布.结果 RT-PCR显示Rab13 GTPase mRNA水平在40日龄大鼠睾丸组织中表达达到最高峰;在40日龄大鼠,Rab13 GTPase在心、脑、肺、脾、睾丸等5种组织中均有表达,在肺组织中表达量最多;在精子细胞成熟过程中,Rab13在生精上皮基底部及生精细胞周围都有分布,在精子释放前则主要集中分布于生精上皮基底部.结论 Rab13 GTPase的分布,可能随生精上皮周期的变化而对精子发生过程具有一定的调节作用.     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

DEHP体外对大鼠睾丸支持细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响

目的:探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)体外对大鼠睾丸支持细胞Bax和Bcl-2基因表达及细胞凋亡的影响。方法:体外分离和原代培养大鼠睾丸支持细胞,不同浓度的DEHP(10、50、100nmol/L)作用于支持细胞24h,荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2基因mRNA表达,Weastern blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与对照组相比,DEHP各组支持细胞Bcl-2基因mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),Bax基因mRNA和蛋白表达增加(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),呈浓度依赖关系。结论:DEHP可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达而诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡,进而影响支持细胞功能。     

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型纹状体中Kir 2基因的表达

目的 研究1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型纹状体中Kir 2家族基因各亚型(Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4)mRNA的表达.方法 构建MPTP诱导的5d亚急性PD小鼠模型,按造模病程设定时间点提取小鼠纹状体总RNA,用Kir 2家族各亚型基因的特异性引物逆转录为cDNA,以荧光染料SYBR green Ⅰ进行荧光实时定量PCR(real-time PCR).检测各特定时间点Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4 mRNA表达.结果 对不同时间点模型样本的real-timePCR检测发现,Kir 2家族4种亚型基因在MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体中均有不同程度表达,其中Kir 2.3和Kir2.4 mRNA随PD病程进展其表达量显著增加(P＜0.05).结论 PD发病机制与纹状体Kir 2家族Kit 2.3、Kir 2.4等亚型基因的表达可能有潜在联系.实验提示Kir 2具有作为潜在PD研究靶点的可能性.     

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型纹状体中Kir 2基因的表达

目的 研究1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型纹状体中Kir 2家族基因各亚型(Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4)mRNA的表达.方法 构建MPTP诱导的5d亚急性PD小鼠模型,按造模病程设定时间点提取小鼠纹状体总RNA,用Kir 2家族各亚型基因的特异性引物逆转录为cDNA,以荧光染料SYBR green Ⅰ进行荧光实时定量PCR(real-time PCR).检测各特定时间点Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4 mRNA表达.结果 对不同时间点模型样本的real-timePCR检测发现,Kir 2家族4种亚型基因在MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体中均有不同程度表达,其中Kir 2.3和Kir2.4 mRNA随PD病程进展其表达量显著增加(P＜0.05).结论 PD发病机制与纹状体Kir 2家族Kit 2.3、Kir 2.4等亚型基因的表达可能有潜在联系.实验提示Kir 2具有作为潜在PD研究靶点的可能性.     

去甲基化药物对胃癌细胞中K A I1基因表达水平影响初探

目的 分别检测正常胃黏膜、低分化胃癌细胞株BGC-823及使用去甲基化药物后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因的表达情况,对胃癌细胞中KAI1基因甲基化对KAI1基因mRNA表达水平的影响做一个初步的探讨.方法 首先采用BSP法分别检测了正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因甲基化的水平.其次,采用RT-PCR法分别检测正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因mRNA量的变化.结果 BSP法检测结果显示BGC-823细胞中KAI1基因出现明显甲基化,正常胃黏膜组织中KAI1基因则未见甲基化;RT-PCR结果显示正常胃黏膜中KAI1基因mRNA表达量达66.68%,而未使用去甲基化药物的BGC-823细胞中KAI1基因mRNA表达量与使用去甲基化药物的胃癌细胞株BGC-823组比较提高了3倍.结论 KAI1基因在胃癌细胞中表现出明显去甲基化,使用去甲基化药物可使胃癌细胞中KAI1的mRNA表达水平明显提高.     

肾细胞癌RASSF1A基因启动子区甲基化状况与表达水平研究

目的 检测19例肾细胞癌患者癌组织及癌旁组织Ras相关区域家族蛋白1A(RASSF1A)基因启动子区甲基化情况并检测其mRNA表达水平,探索两者之间的联系.方法 收集肾细胞癌患者癌组织及相应癌旁组织19份,分别提取其基因组DNA,以甲基化特异性PCR(Methylation special PCR, MSP)法检测RASSF1A基因启动子区甲基化情况,并以QPCR法检测了RASSF1A基因的mRNA表达水平.结果 19例中有10例肾细胞癌患者癌组织存在高甲基化, mRNA表达水平表达降低,二者之间存在显著负相关性(r=-0.8734, P<0.01).结论 肾细胞癌中RASSF1A基因启动子区存在高甲基化,并抑制该基因的表达.