牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

诺如病毒GⅡ.17型在盘锦地区的检出和鉴定

目的对盘锦市一所中学暴发的一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,鉴定其病原体,并进一步对其基因分型和分析。方法对9份疫情样本采用荧光定量PCR法进行NV GⅠ型和NV GⅡ型检测,对阳性样本进行RNA电泳,挑取条带清晰样本进行产物纯化、测序和基因数据库比对,并用Bio Edit软件构建序列进化树。结果在15份样本中,有7份样品检出NV GⅡ型阳性,选取4份阳性样本进行RT-PCR扩增、测序,将所得数据进行比对后发现为NV GⅡ.17型和NV GⅡ.4型。结论经测序结果证实该疫情为诺如病毒所致,为NV GⅡ.17型和NV GⅡ.4型混合感染,NV GⅡ.17在本地区首次检出,未发现NV GⅡ.4/Sydney变异株。     

单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型

目的建立能同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法。方法分别选用轮状病毒NSP3基因、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型orf1与orf2基因中的64 bp、90 bp和185 bp片段作为荧光定量PCR检测的靶标,设计引物和Taq Man探针,构建标准品,绘制标准曲线,评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度,并对138份粪便标本进行检测及测序验证。结果 3种病毒对应的标准曲线分别为:轮状病毒:y=-3.9lgx+41.204;诺如病毒GⅠ型:y=-3.06lgx+40.716;诺如病毒GⅡ型:y=-3.29lgx+41.538,质粒标准曲线的方差系数为0.997,灵敏度达到每个反应102copy/μl,特异度强。138份样本中检出A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的检出率分别为32.6%、5.8%和26.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建可用于A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

南宁市2007～2008年诺如病毒感染所致成人腹泻散发病例的流行病学特征和诺如病毒基因型分布

目的研究诺如病毒(Norovirus,NV)感染所致成人腹泻散发病例的流行病学特征和NV基因型分布。方法对南宁市2007～2008年某医院门诊696例成人腹泻散发病例资料进行流行病学分析,并采集粪便标本,应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测NV及其基因组别。随机选择部分阳性标本进行NV衣壳蛋白N/S区核苷酸序列测定,确定基因型。结果NV所致散发性成人腹泻在冬春季节呈现高发。在696份散发成人腹泻的粪便标本中,NV核酸检测阳性183份,总阳性率26.30%。其中180份(98.36%)NV属于基因Ⅱ组(GenogroupⅡ,GⅡ),另外3份(1.64%)为基因Ⅰ组(GⅠ)。随机选择10株GⅡNV进行核苷酸序列分析,它们均属于GⅡ.4基因型,而3株GⅠNV分属于GⅠ.2、GⅠ.4、GⅠ.8基因型。结论NV是南宁市2007～2008年成人腹泻散发病例的主要病原体,优势毒株为GⅡ.4型,也存在GⅠ型NV感染。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

南宁市散发性腹泻诺如病毒分子流行病学分析

目的 研究广西南宁市散发性腹泻病例中诺如病毒( norovirus,NV)感染的分子流行病学特征.方法 对2007年1月- 2008年12月南宁市某医院门诊696例散发腹泻病例进行流行病学资料分析,并应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应对其粪便标本进行NV及其基因组别检测;随机选择部分阳性标本进行核苷酸序列测定和遗传进化树分析,确定基因型.结果 在696份粪便标本中,NV核酸检测阳性183份,总阳性率26.30％,其中180份(98.36％)属于基因Ⅱ组(genogroupⅡ,GⅡ),另外3份(1.64％)为基因Ⅰ组(GⅠ);随机选择30株GⅡ组NV进行核苷酸序列分析,绝大多数属于GⅡ.4基因型(26株),其余为GⅡ.12(2株)、GⅡ.7(1株)、GⅡ.16(1株);3株GⅠ组NV分属于GⅠ.2、GⅠ.4、GI.8型;NV所致散发性腹泻在冬春季节呈现高发.NV阳性检出率无性别和年龄组差异.结论 NV是南宁市散发性腹泻病例的主要病原体,优势毒株为GⅡ.4型,同时存在多种其他基因型感染.     

一起诺如病毒所致急性胃肠炎的病原学调查

目的确定天津市一起水源性急性胃肠炎暴发的致病原。方法采集病例粪便标本,饮用深井水标本,采用荧光定量(Real-time PCR)检测病毒核酸,包括轮状病毒、杯状病毒、星状病毒和肠道腺病毒,阳性标本进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增及测序分析。对粪便标本进行常见肠道致病菌的检测。结果采集粪便标本33份,检出诺如病毒GⅠ型阳性5份(15.2%),诺如病毒GⅡ型阳性12份(36.4%),诺如病毒GⅠ型、GⅡ型均阳性3份(9.1%)。经测序分析1株GⅠ型为GⅠ/14基因型;4株GⅡ型中,2株为GⅡ/8型,1株为GⅡ/6型,1株为GⅡ/2基因型。轮状病毒(A,B,C组)、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒和肠道致病菌检测均为阴性。3份饮水标本中轮状病毒(A,B,C组)、诺如病毒(GⅠ型,GⅡ型)、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒检测均为阴性,常见肠道致病菌检测结果均为阴性。结论本次水源性急性胃肠炎暴发系由诺如病毒GⅠ型/Ⅱ型混合感染引起。     

双重实时荧光定量PCR法检测腹泻患者粪便中诺如病毒(GⅠ+GⅡ)的研究

目的建立同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重实时荧光定量PCR方法,并在临床检验中得到应用。方法本研究采用了双重实时荧光定量PCR法,对诺如病毒GⅠ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了FAM和对诺如病毒GⅡ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了JOE,从而实现了在同一反应管中对诺如病毒同时进行检测和分型。2015年采集两所哨点医院符合要求的门诊腹泻患者的380份粪便标本运用此方法进行了检测和分型。结果诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型分别在FAM检测通道和JOE检测通道出现相应的荧光扩增曲线;380例符合定义的临床标本中诺如病毒GⅠ型的检出率为3.68%,诺如病毒GⅡ型的检出率为14.74%,诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型混合感染的检出率为1.58%,全年诺如病毒的总检出率为20.00%。结论双重实时荧光定量PCR法具有重复性好、特异性强、时效性好和简单易操作的特点,具有极大的应用和推广价值。     

广州市1起诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测

目的确定1起学校急性胃肠炎暴发原因。方法采集病例粪便标本,直饮水标本,采用实时荧光定量(Real-time)PCR和RT-PCR方法检测病毒核酸,阳性标本测序分析。结果 5份粪便标本中3份呈诺如病毒阳性,2份直饮水标本均呈诺如病毒阳性。3份病例粪便标本病毒株核苷酸序列一致,均为GⅡ-4型,提示病毒同源。结论对诺如病毒进行核酸检测,证实该疫情为一起诺如病毒GⅡ-4型引起的急性胃肠炎暴发。     

南宁市散发性急性胃肠炎病例中检出GⅠ.8型诺如病毒

目的研究南宁市某医院散发性急性胃肠炎病例中,GⅠ.8型诺如病毒(Norovirus,NV)的基因特征。方法采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应,对2007年1月～2008年12月南宁市某医院散发性急性胃肠炎病例标本检测基因Ⅰ型(GenogroupⅠ,GⅠ)NV核糖核酸,对阳性标本进行N/S区核苷酸序列测定,并构建系统进化树分析。结果在696份粪便标本中,检出3份GⅠ型NV核酸阳性。经核酸序列分析发现,其中一份[南宁(Nanning,NN)07230]与GⅠ.8型参考株(WUGⅠ/00/JP)的核苷酸序列同源性达94.5%;与2006～2007年日本、韩国公布的GⅠ.8型NV核苷酸序列同源性范围在96.7%～98.5%。NN07230在进化树中与GⅠ.8型病毒株属同一分支。结论在南宁市散发性急性胃肠炎病例中存在GⅠ.8型NV感染。     

粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用

目的 构建诺如病毒GⅡ（Norovirus Genogroup Ⅱ,NoV GⅡ）拷贝数标准质粒及其检测体系。方法 将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应（PCR）进行验证。通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制Ct值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测。结果 经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确。采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得Ct值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R²=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30 443.45、9 468.40、53 176.69、4 493.12 copies/μL。结论 成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法。     

大连市首次在急性胃肠炎暴发疫情标本中检出GⅠ型诺如病毒

目的为确定引起大连市某幼儿园急性胃肠炎暴发疫情的病原体,对患儿粪便和呕吐物标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT-PCR法对12份标本进行GⅠ型和GⅡ型诺如病毒RNA检测。结果 12份患儿标本中,9份GⅠ型诺如病毒核酸阳性。结论首次在大连地区发现由GⅠ型诺如病毒引起的暴发疫情。     

2015—2016年江苏地区双壳贝类海产品中诺如病毒携带状况

目的了解江苏地区流通环节双壳贝类中诺如病毒(Norovirus,NV)携带和流行状况,为预防食源性疾病的发生和食品安全风险评估提供基础资料。方法 2015年7月—2016年6月,从江苏6个市(县)的流通和养殖环节采集657份贝类海产品样本,采用RT-PCR法检测NV。结果共采集657份标本,监测标本NV阳性率为15.22%,以GⅡ型为主(13.39%),其次为GⅠ型(6.85%)、GⅠ+GⅡ型NV同时检出(5.02%),不同亚型NV阳性率差异有统计学意义(χ~2=11.389,P<0.05)。不同双壳贝类NV检出率差异有统计学意义(χ~2=67.677,P<0.05),牡蛎中NV感染率最高(24.83%);不同地区样品阳性率的差异有统计学意义(χ~2=21.67,P<0.05),东台阳性率最高(23.64%)。不同季度双壳贝类阳性率的差异有统计学意义(χ~2=9.518,P<0.05),2016年第一季度阳性率最高(18.16%)。结论牡蛎为携带NV的高危食品,沿海城市中销售的双壳贝类感染水平较高,NV携带存在季节性的变化。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

秦皇岛市海产品贝类中诺如病毒监测分析

目的了解秦皇岛市海产品中血蚶、牡蛎、海虹受诺如病毒污染情况,检测3种贝类带毒率,对检测出的诺如病毒进行GⅠ和GⅡ分型。建立Mengo病毒作为阳性质控检测病毒回收率方法。方法蛋白酶水解法富集病毒,全自动核酸提取仪提取病毒RNA,实时荧光定量PCR方法对诺如病毒进行检测和分型,用Mengo病毒做标准曲线,检测诺如病毒回收率。结果 Mengo病毒回收率均1%符合富集要求,检测牡蛎、海虹、血蚶各20份,检出诺如病毒阳性样本11份,其中GⅠ型1株,GⅡ型10株,总检出率为18.33%。牡蛎、血蚶均检出GⅡ型毒株,检出率分别为30.00%、5.00%,海虹检出GⅠ型和GⅡ型毒株,检出率分别为5.00%和15.00%。结论 3种贝类产品均受到诺如病毒不同程度的污染,GⅡ毒株含量较多,牡蚶和海虹受到污染较为严重。     

南宁市朝阳溪污水中诺如病毒GⅡ.4型变异株基因分析

目的了解南宁市朝阳溪污水中诺如病毒(Norovirus,NV)GⅡ.4变异株的基因特征。方法 2011年1~12月采集72份南宁市朝阳溪污水,经实时荧光逆转录-聚合酶反应(Realtime RT-PCR)方法进行NV核糖核酸(RNA)检测,阳性标本进行基因克隆测序和遗传进化分析。结果 72份污水中均能检测到NV RNA,基因Ⅰ组(GenogroupⅠ,GⅠ)NV RNA阳性率为70.83%,基因Ⅱ组(GenogroupⅡ,GⅡ)阳性率则达100.00%,共为16个基因型,有18株为GⅡ.4型,其中2株为2006b变异株,其余16株均为2010变异株。检测到的2006b变异株和2010变异株在衣壳蛋白N/S区第94位氨基酸均发生变异,而在第6位、第15位仅2010变异株发生了变异,2006b变异株(除SW2011041-2株外)均无变异。这些变异株与同年南宁市腹泻病例中NV GⅡ.4型变异株核苷酸型内同源性分别为96.70%~98.93%和97.42%~99.64%。结论南宁市朝阳溪污水中NV存在很高的遗传多样性,其来源可能是周边居民中的感染者;GⅡ.4型NV中2010变异株为优势株,其在人群中可能存在隐性感染;污水监测是人间NV感染监测的重要补充。     

2014年厦门地区市售牡蛎诺如病毒污染状况调查分析

目的调查2014年厦门地区市售牡蛎中GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的污染状况,为食用诺如病毒污染的牡蛎引起的胃肠炎提供预警信息和防控建议。方法 2014年1月-2014年11月对厦门地区市售牡蛎进行连续采样,利用实时荧光定量RT-PCR法对样品中诺如病毒进行检测,确定牡蛎中诺如病毒污染状况及基因型分布状况。结果 198份牡蛎样品中诺如病毒总检出率为22.7%,GⅠ型No Vs检出率为6.1%,GⅡ型No Vs检出率为9.1%,GⅠ型和GⅡ型No Vs同时检出率为7.1%;消化腺中诺如病毒RNA载量水平为400 copy/g~485 000 copy/g,均值为9 500 copy/g。结论 2014年厦门地区市售牡蛎的诺如病毒污染情况较严重,GⅠ型和GⅡ型No Vs均有污染,建议相关部门采取措施,降低人群感染诺如病毒的风险。