11,12-环氧二十碳三烯酸对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的通过观察11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-EET)对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞损伤程度的影响,了解EET血管保护的可能途径,并初步探讨其作用机制。方法采用原代培养人脐静脉内皮细胞,随机分为对照组、缺氧/复氧组、11,12-EET对照组、11,12-EET缺氧/复氧组、细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK1/2)抑制组和一氧化氮合酶抑制组。通过向培养瓶内通入混合气体(2%O2,5%CO2,93%N2)3h,复氧1h复制缺氧/复氧损伤模型。采用MTT法检测细胞存活率,比色法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的变化,Westernblot方法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和ERK1/2的表达。结果11,12-EET在常氧条件下可对细胞造成轻度损伤,而在缺氧/复氧条件下能显著提高内皮细胞的存活率,降低LDH的漏出率,提高SOD的活性,降低MDA的含量,并且促进eNOS、磷酸化ERK1/2的表达。结论11,12-EET具有拮抗内皮细胞缺氧/复氧损伤作用,这与其提高缺氧/复氧内皮细胞SOD活性、清除氧自由基、减少缺氧/复氧对eNOS及磷酸化ERK1/2表达的抑制有关。     

川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响*

[目的]探讨川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响.[方法]培养人心脏微血管内皮细胞,建立缺氧复氧模型,分离人外周血白细胞,计数法检测白细胞内皮细胞黏附率,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测内皮细胞黏附分子表达.[结果]缺氧培养2 h,恢复正常培养1 h,心脏微血管内皮细胞白细胞黏附率明显增加,川芎嗪、阿魏酸可降低缺氧复氧心脏微血管内皮细胞与白细胞黏附.缺氧2h复氧0.5 h,细胞间黏附分子-1(ICAM-1),P选择素mRNA的表达较正常组升高,缺氧2 h复氧4h,ICAM-1,P选择素,E选择素mRNA的表达较正常组升高.阿魏酸和川芎嗪均不同程度降低ICAM-1、P选择素、E选择素mRNA的表达.[结论]川芎嗪、阿魏酸可通过降低内皮细胞黏附分子表达,降低白细胞内皮细胞黏附,从而可能成为预防及治疗缺血再灌注损伤的有效方法.     

川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响

[目的]探讨川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响。[方法]培养人心脏微血管内皮细胞,建立缺氧复氧模型,分离人外周血白细胞,计数法检测白细胞内皮细胞黏附率,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测内皮细胞黏附分子表达。[结果]缺氧培养2h,恢复正常培养1h,心脏微血管内皮细胞白细胞黏附率明显增加,川芎嗪、阿魏酸可降低缺氧复氧心脏微血管内皮细胞与白细胞黏附。缺氧2h复氧0.5h,细胞间黏附分子-1(ICAM-1),P选择素mRNA的表达较正常组升高,缺氧2h复氧4h,ICAM-1,P选择素,E选择素mRNA的表达较正常组升高。阿魏酸和川芎嗪均不同程度降低ICAM-1、P选择素、E选择素mRNA的表达。[结论]川芎嗪、阿魏酸可通过降低内皮细胞黏附分子表达,降低白细胞内皮细胞黏附,从而可能成为预防及治疗缺血再灌注损伤的有效方法。     

油茶皂苷对缺氧-复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的影响

目的研究油茶皂苷(SQS)对缺氧-复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的作用及可能的机制。方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧-复氧损伤模型,取培养细胞上清液测定LDH活性,分别测定HU-VEC存活率,中性粒细胞黏附率、线粒体丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。同法检测中性粒细胞黏附。结果缺氧-复氧可导致HUVEC损伤及中性粒细胞黏附的增加,表现为LDH活性、MDA水平及中性粒细胞黏附率显著升高,而SOD和GSH-Px活性显著下降;SQS呈浓度依赖性地对抗上述改变。结论SQS对缺氧-复氧诱导的HUVEC损伤有保护作用,其机制可能与其抗脂质过氧化和抑制白细胞黏附有关。     

缺氧复氧性损伤对培养海马细胞ICAM-1表达影响及银信达莫的保护作用

目的研究缺氧复氧性损伤对培养海马细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达影响及银信达莫的保护作用,探讨其可能的机制。方法将SD大鼠分设正常条件培养组、单纯缺氧复氧组(HR)、缺氧复氧+银信达莫组,于缺氧1h后复氧6h,测定海马细胞ICAM-1表达水平及细胞胞浆游离钙([Ca2+]i)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)水平。结果海马细胞缺氧复氧刺激时,ICAM-1蛋白质表达[、Ca2+]i和MDA均有显著增加,而SOD、GSH、NOS明显下降;银信达莫可明显改善缺氧复氧性海马细胞ICAM-1的表达和MDA[、Ca2+]i超载增高的程度以及SOD、GSH、NOS下降程度。结论海马细胞缺氧复氧通过直接或间接激活ICAM-1引起细胞损伤,但钙超载、氧自由基和NOS系统也共同参与了缺氧复氧性损伤。银信达莫通过直接或间接抑制上述各系统而达到减轻缺氧复氧性损伤。     

缺氧-复氧肾小管上皮细胞损伤的信号传导机制

目的 探讨肾小管上皮细胞在缺氧-复氧(H-R)损伤后的信号传导机制.方法 将不同方法处理的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)分为对照组、模型组和PDTC组,模型组和PDTC组再分别分成缺氧6、12、24 h组、缺氧24 h后分别复氧6、12、24 h组;检测细胞成活率、NF-κB p65蛋白表达、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA及蛋白表达情况.结果 与对照组比较,模型组随缺氧时间延长细胞数量逐渐减少,24 h达高峰(P＜0.05),复氧后细胞数量略有增加;随缺氧时间延长NF-κB p65阳性蛋白表达增多,复氧6h组达高峰(P＜0.05);ICAM-1 mRNA及蛋白表达随H-R时间延长渐增高(P＜0.05).PDTC组中NF-κBp65蛋白和ICAM-1 mRNA及蛋白表达较模型组有明显下降(P＜0.05).结论 H-R诱导HK-2细胞中NF-κcB p65的活化,从而上调ICAM-1 mRNA及蛋白表达.     

胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究胡黄连提取物对缺氧/复氧后肾小管上皮细胞氧化应激的保护作用和机制。方法:采用小鼠肾小管上皮细胞建立缺氧/复氧损伤模型,分别用不同梯度浓度胡黄连苷Ⅱ(1,10,100,1 000μg/ml)进行药物干预。MTT法检测细胞活性,BCA蛋白质分析试剂盒检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,免疫组化检测Bax蛋白的表达,Western Blot法检测高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达,Realtime PCR检测Bax和Bcl-2mRNA表达。结果:与正常组相比,各缺氧/复氧组细胞内氧化应激水平增高,凋亡细胞或死亡细胞数量明显增加。与单纯缺氧/复氧组比较,不同浓度梯度的胡黄连苷Ⅱ可抑制细胞内的氧化损伤。胡黄连苷Ⅱ使肾小管上皮细胞增殖活性增强,细胞凋亡数量减少,培养液中MDA含量下降、SOD活性增强,Bax蛋白和HMGB1蛋白表达下调,Bax mRNA水平下调,Bcl-2mRNA水平上调。结论:缺氧/复氧导致肾小管上皮细胞内氧化应激增强,胡黄连苷Ⅱ能通过抑制肾小管细胞内氧化应激来改善缺氧/复氧后的细胞凋亡和坏死。     

11,12-环氧二十碳三烯酸对缺血前和再灌注前大鼠心肌钙调节蛋白的影响

目的观察11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-EET)预处理与后处理对缺血/再灌注(IR)大鼠心肌钙调节蛋白的影响,探讨11,12-EET心肌保护的作用及其机制。方法采用Langendorff离体灌流装置,通过停灌40min/复灌30min复制大鼠心肌IR损伤模型。将33只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、IR组、EET预处理组(Pre-EET)及EET后处理组(Post-EET)。采用BL-420生物信号采集系统监测心功能,比色法检测肌浆网Ca2 -ATPase变化,半定量RT-PCR方法检测钙泵(SERCA)、磷酸受纳蛋白(PLB)、兰尼碱受体2型(RyR2)及1,4,5-三磷酸肌醇受体2型(IP3R2)表达变化。结果Pre-EET及Post-EET组与IR组相比,心功能改善、Ca2 -ATPase活性增高(P<0.05,P<0.01);IP3R2表达增强,PLB表达降低(P<0.05,P<0.01);Pre-EET组SERCA表达增强(P<0.05)。Pre-EET与Post-EET组间差异无显著性;各组RyR2表达差异无显著性。结论11,12-EET预处理与后处理具有拮抗IR损伤的作用,这与其诱导肌浆网IP3R2表达上调,PLB表达下调以及改善Ca2 -ATPase的活性有关;同时,预处理肌浆网SERCA表达上调,也可能是其抗IR损伤机制之一。     

缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化

目的:研究缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化. 方法:通过胶原酶/胰酶联合消化法获取成人肥大心肌细胞,采用缺氧-复氧诱导细胞凋亡,改良TUNEL法检测细胞凋亡率,并用免疫细胞化学法检测bcl-2、bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白的变化,用原位杂交法检测bcl-2 mRNA、caspase3 mRNA和Akt1 mRNA表达的变化. 结果:缺氧24 h-复氧4 h后细胞凋亡率为(17.50±0.67)%,对照组为(2.88±0.27)%;凋亡信号的平均吸光度(A)值:bcl-2为0.189±0.006,对照组为0.238±0.004;bax为0.240±0.002,对照组为0.218±0.004;caspase-3为0.230±0.002,对照组为0.202±0.004;细胞色素C为0.225±0.003,对照组为0.191±0.009;磷酸酪氨酸蛋白为0.186±0.005,对照组为0.154±0.003;bcl-2 mRNA为0.300±0.003,对照组为0.360±0.001;caspase 3 mRNA为0.307±0.004,对照组为0.271±0.002;Akt1 mRNA为0.274±0.007,对照组为0.301±0.008,差异均有统计学意义(P<0.01). 结论:缺氧-复氧可造成人肥大心肌细胞凋亡,bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA和Akt1 mRNA表达降低,bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白及caspase3 mRNA表达增加.     

11,12-环二十碳三烯酸对心脏缺血/再灌注损伤大鼠血红素氧合酶-1的影响

目的观察11,12-环二十碳三烯酸(11,12-EET)对缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠心肌血红素氧合酶-1(HO-1)的影响,并探讨其作用机制。方法采用健康雄性Wistar大鼠制备心肌缺血/再灌注模型,实验分为3组:1)缺血/再灌注(I/R)组,2)环氧二十碳三烯酸(EET)组及3)左旋精氨酸甲酯(L-NAME)组。观察缺血60min再灌注30min时心脏收缩期左心室内压上升的最大变化速率及舒张期左心室内压下降的最大变化速率。采用Westernblot法测定心肌HO-1表达水平。采用化学比色法观察大鼠心肌组织NOS及iNOS活性。结果收缩期左心室内压上升的最大变化速率及舒张期左心室内压下降的最大变化速率EET组高于I/R组(P<0.01);L-NAME组低于EET组(P<0.05)。心肌HO-1表达水平EET组高于I/R组(P<0.05),L-NAME组低于EET组(P<0.05)。EET组cNOS活性高于I/R组(P<0.01),L-NAME组cNOS活性低于EET组(P<0.05);EET组iNOS活性低于I/R组(P<0.01),L-NAME组iNOS活性低于EET组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论外源性11,12-EET能改善缺血/再灌注大鼠心功能损伤程度,增加心肌HO-1表达水平和cNOS活性,降低iNOS活性。提示11,12-EET拮抗心肌缺血/再灌注损伤的作用可能与HO-1表达增加有关,且此时HO-1的表达增加至少部分依赖于cNOS的激活。     

sRAGE对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响

目的观察可溶性晚期糖基化终产物(soluble form of receptor for advanced glycation end products,sRAGE)对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响。方法乳鼠心肌细胞原代培养48 h,以低氧3 h、复氧2 h复制缺氧/复氧损伤模型,采用抽签法将乳鼠心肌细胞随机分为4组:常氧对照组(Control,Con)、常氧+sRAGE组(Con-sRAGE)、缺氧/复氧组(Hypoxia/reoxygenation,H/R))、缺氧/复氧+sRAGE组(H/R-sRAGE)。采用四甲基偶氮唑蓝〔3(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyl-tetrazolium,MTT〕比色法检测心肌细胞活力和培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)浓度,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针联合流式细胞仪检测细胞荧光强度-反应活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,硝酸还原酶法测定一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果与H/R组相比,H/R-sRAGE组可以提高心肌细胞活力,减少LDH漏出量,增加SOD活力,降低MDA、ROS、NO含量(P<0.05)。结论 sRAGE可以直接作用于心肌细胞拮抗缺氧/复氧损伤,其保护性作用与抑制氧化应激有关。     

裸质粒与脂质体介导转染方法对大鼠平滑肌细胞CYP2J3基因表达的影响

目的比较脂质体介导法和裸质粒直接转染法导入CYP2J3基因表达的效率。方法将CYP2J3真核表达质粒导入原代培养大鼠平滑肌细胞,用半定量RT-PCR方法检测CYP2J3 mRNA表达,Western blotting方法测定CYP2J3蛋白表达,高效液相色谱法测定培养液11,12-EET含量。实验分为裸质粒转染组(2J3)、脂质体介导转染组(L2J3)和对照组,转染后24h和48h收集细胞。结果转染后24h,2个转染组CYP2J3 mRNA表达均较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);L2J3组蛋白含量较对照组低,差异有统计学意义(P<0.01),2J3组蛋白含量较L2J3组高,差异有统计学意义(P<0.05)。培养液11,12-EET含量在3组间差异无统计学意义。转染后48h2个转染组CYP2J3 mRNA表达较24h时弱,但仍较对照组高,脂质体转染组较裸质粒转染组CYP2J3 mRNA表达增强;2J3组及L2J3组蛋白含量均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.01);2个转染组培养液中11,12-EET浓度较对照组高,脂质体转染组表达高于裸质粒转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论裸质粒直接转染能成功导入CYP2J3基因并表达产物。     

氯化钴预处理对缺氧预适应小鼠海马组织HIF-1α表达的影响

目的检测氯化钴预处理后小鼠海马组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在急性重复氧过程中的变化及其可能的机制。方法用数字表法将Balb/C小鼠随机分为氯化钴实验组和生理盐水对照组,2组动物分别在实验前3 h注射氯化钴和生理盐水,进行0次(H0)、1次(H1)、4次(H4)缺氧暴露,随即分别取海马组织,用Western blot及EMSA法检测HIF-1α蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性。结果生理盐水预处理后,小鼠的缺氧耐受时间逐次显著递增;氯化钴预处理后缺氧耐受时间恒定增高。氯化钴预处理H0、H1、H4组海马组织的HIF-1α蛋白质含量差异未见统计学意义,但HIF-1 DNA结合活性在H1组升高、H4组降低。生理盐水预处理组海马组织的蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性在H0、H1、H4组均依次增加。结论氯化钴预处理能显著增强小鼠对缺氧的耐受能力、激活海马组织中的HIF-1,但其分子机制可能与急性重复缺氧暴露增强缺氧耐受力的机制不同。     

抑制低氧诱导因子-1α对PC12细胞存活的影响

目的通过抑制低氧诱导因子-1α转录活性,研究低氧诱导因子-1α在低氧诱导的细胞死亡中的作用。方法①将PC12细胞接种于12孔板,在20%常氧和3%低氧环境中培养24 h,在光镜下拍照并应用计数方法记录PC12细胞的生长情况。②将PC12细胞接种于96孔板,在常氧和低氧环境中培养24 h后,用细胞活力检测剂(a novel tetrazolium compound,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt,MTS)检测PC12细胞的生长情况。③在常氧和低氧条件下分别用5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞24 h和48 h后,用MTS法检测细胞活力。结果①细胞计数和MTS法检测细胞活力的结果均显示3%的低氧条件可明显诱导PC12细胞死亡。②不同浓度的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞24 h之后,低氧和常氧的细胞活力没有显著区别。③不同浓度的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞48 h之后,低氧不再促进细胞死亡,相反,低氧条件处理的细胞活力明显好于常氧。结论低氧会促使PC12细胞死亡,棘霉素抑制HIF-1α的转录活性24 h后,低氧对PC12细胞的促死亡作用减弱;48 h后,低氧组的细胞活力还可超过常氧组。这表明,低氧下过量的HIF-1α转录激活对细胞是有害的。     

脯氨酸羟化酶抑制剂对人肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

 目的 探讨脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）通过稳定人肾小管上皮细胞（HKC）中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达抗缺氧/复氧损伤（HRI）的作用及其机制。方法 无糖缺氧12 h,复氧6 h制作HKC细胞HRI模型,分别于缺氧前2、4、6、12 h给予DMOG预处理,四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测细胞增殖活性,试剂盒检测细胞培养液中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性,Annexin/PI染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR方法检测bcl-2和bax mRNA的表达,Western印迹检测HIF-1α、bcl-2和bax蛋白的表达。结果 DMOG预处理使HKC中HIF-1α表达增加,细胞损伤明显改善,表现为细胞增殖活性提高,培养上清液中MDA含量下降、SOD活性增强,细胞凋亡率下降（P<0.05）;同时bax mRNA和蛋白表达下调（P<0.05）,bcl-2 mRNA和蛋白表达上调（P<0.05）。结论 DMOG可通过稳定HIF-1α,影响凋亡相关基因的表达,改善HRI诱导的HKC细胞损伤。     

麝香保心丸对心力衰竭大鼠肾脏血管紧张素Ⅱ受体各亚型表达的影响

目的探讨麝香保心丸对心力衰竭大鼠肾脏血管紧张素Ⅱ受体(angiotensinⅡreceptor,ATR)各亚型表达水平的影响。方法选择雄性Wistar大鼠80只,采用抽签法随机分为正常对照组(A组,10只)、假手术组(B组,10只),其余60只制作心肌梗死后心力衰竭模型,35只大鼠模型制作成功,并采用抽签法随机分为模型组(C组,9只)、阳性药物对照组(D组,8只)、麝香保心丸小剂量组(E组,9只)和麝香保心丸大剂量组(F组,9只)。取大鼠肾脏皮质,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别测定各组大鼠ATR各亚型mRNA表达水平。结果 B组与A组AT1R、AT2R比较,差异无统计学意义(P>0.05);与B组比较,C组大鼠AT1R表达明显上调,AT2R表达明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D、E、F组大鼠AT1R表达明显下调,AT2R表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);与E组比较,F组大鼠AT1R表达下调更显著(P<0.05)。结论采用麝香保心丸治疗,可调节大鼠肾脏ATR各亚型的表达,使心力衰竭时上调的AT1R表达下调,下调的AT2R表达上调,对保护肾脏功能、改善心力衰竭起到了有益作用。同时,与小剂量麝香保心丸相比,大剂量麝香保心丸的疗效更为显著。     

内源性H_2S对糖尿病肾病细胞外基质积聚的作用

目的观察糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾组织中纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)分布及含量变化,探讨内源性硫化氢(H2S)对糖尿病肾病细胞外基质积聚的作用。方法雄性SD大鼠28只用数字表法随机分为对照组、DN组、H2S干预组和胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)阻断剂组,每组7只。用免疫组织化学法及Western blotting免疫印迹法检测各组大鼠肾组织中FN分布及含量。结果1)对照组大鼠FN主要分布于系膜基质和肾小囊壁;DN组和CSE阻断剂组大鼠肾小球基质中FN的分布增加;与DN组及CSE阻断剂组比较,H2S组大鼠FN的分布明显减少。2)与对照组比较,DN组大鼠FN的含量增加,Western blotting检测结果显示,DN组(48896±779)与对照组(38531±902)比较差异有统计学意义(P<0.01);与DN组、CSE阻断剂组比较,H2S组中FN的含量下降,Western blotting结果显示,H2S干预组(42737±1196)与DN组(48896±779)、CSE阻断剂组(48252±1068)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论内源性H2S可抑制DN大鼠肾脏中细胞外基质的过度积聚,延缓糖尿病肾病的病理改变。