甘草酸人工抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的制备中药甘草的活性成分甘草酸(GA)的人工抗原及抗血清,为制备GA的单克隆抗体、并建立快速检测GA的酶联免疫吸附测定(ELISA)提供技术基础。方法将GA与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联起来制得完全抗原后,经基质辅助激光解吸飞行时间质谱鉴定其相对分子质量,用此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,并通过间接ELISA法和竞争ELISA法检测其抗体效价和特异性。结果合成的人工抗原GA-BSA中GA与BSA的结合比约为7∶1;免疫小鼠得到特异针对GA的多抗血清,GA抗体的效价为1∶8000。结论成功地合成了GA的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性,可应用于建立GA的免疫分析方法。     

活泼酯法合成绿原酸人工抗原及其鉴定

目的人工合成绿原酸(chlorogenic acid,CGA)完全抗原并进行鉴定,为制备绿原酸单克隆抗体奠定基础。方法采用活泼酯法,将绿原酸分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和卵白蛋白(ovalbumin,OVA)进行偶联,用紫外扫描法、SDS-PAGE电泳法进行鉴定;间接ELISA法测定免疫小鼠血清抗体效价。结果经紫外扫描法和电泳法检测,CGA与载体蛋白成功偶联,免疫小鼠后获得的多抗血清效价达到1×106。结论成功合成绿原酸完全抗原,可用于绿原酸单克隆抗体的制备。     

丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：以基因工程表达的丙型肝炎病毒抗原蛋白（HCAg）为抗原，建立分泌单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系．并对其分泌的McAh进行鉴定。方法：用纯化HCV基因工程表达抗原（HCAg）免疫Balb／c小鼠，取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备McAb。采用ELISA及分片断鉴定技术进行鉴定。结果：筛选出5株能稳定分泌特异性抗-HC的McAb杂交瘤细胞株，经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体，特异性强，效价高。与不同抗原蛋白的ELISA反应呈特异性阳性反应。分片断鉴定结果显示，所获5株McAb主要为抗HCV核心蛋白和非结构蛋白NS3。结论：此5株丙肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丙肝抗原具有特异亲和性，为丙型肝炎病毒抗原诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

整合素阻断剂AP25单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备整合素阻断剂AP25的单克隆抗体,鉴定其效价和特异性.方法 从抗原免疫BALB/c小鼠分离免疫脾细胞,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株并进行扩大培养.采用小鼠体内诱生法制备腹水,进行纯化后得到抗AP25单克隆抗体,用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性.结果 ELISA检测抗AP25单克隆抗体效价可达1∶2×106,Western blot鉴定抗体特异性良好.结论 获得了能够高表达抗AP25单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水制备抗体,纯化后得到效价高、特异性良好的AP25单克隆抗体.     

氯胺酮人工抗原的合成与鉴定

目的:利用化学方法将氯胺酮半抗原与载体蛋白偶联制备氯胺酮人工抗原。方法:结构修饰后的氯胺酮类似物与载体BSA蛋白经戊二醛法连接合成氯胺酮人工抗原,利用紫外光谱扫描法、蛋白质电泳法和胶体金免疫层析法进行检测。结果:氯胺酮人工合成抗原连接成功,胶体金免疫层析检测结果显示该合成抗原与抗氯胺酮抗体有特异性反应,具有活性,交叉反应少。结论:该方法合成的氯胺酮人工抗原可作为免疫源性抗原用于制备抗氯胺酮抗体,也可作为氯胺酮免疫检测方法中包被抗原用于氯胺酮的检测。     

抗脂联素单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的:探讨抗脂联素(adiponectin,APN)单克隆抗体(McAb)的制备方法及其免疫学特性.方法:采用FMP有机化学同相合成法合成APN,用HPLC进行纯化,以此合成抗原免疫BALB/c小鼠,制备McAb,并对抗体的效价、特异性、亚类及位点进行测定.结果:融合后的克隆率为85.4%,阳性率3.2%,腹水效价为1.0×102,与内脂素、瘦素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白无交叉反应,A2、A3、A4、A6、A8为lgG2a,A1、A2、A7为IgG2b.经单抗体相加试验和双抗体竞争试验证实,A1针对一个抗原位点,A3和A3针对另一个抗原位点.结论:利用合成的APN免疫动物可成功制备抗APN McAb,该抗体效价高、特异性强.     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

2型猪链球菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogen-ase,GDH）的单克隆抗体。方法分别以2型S.suis全菌细胞和重组GDH蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株并克隆化;免疫印迹（Western blot）鉴定GDH单克隆抗体的特异性;制备小鼠腹水并进行抗体效价测定。结果细胞融合后经ELISA筛选获得分泌的阳性细胞株,经过有限稀释克隆化筛选,获得4株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单抗腹水的抗体效价均在1∶102400以上。结论本研究获得了4株能稳定分泌抗体且其分泌的抗体能够与GDH蛋白进行特异性反应的单克隆抗体细胞株,所获得特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,也能够进一步用于猪链球菌感染血清学诊断方法研究。     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。     

抗前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的　制备抗前列腺干细胞抗原 (PSCA)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特性进行鉴定。方法　应用PC 3细胞免疫BALB/c小鼠 ,按常规方法融合并经间接ELISA方法筛选 ,制备稳定的抗PSCAMcAb ,并对McAb的亚型、组织特异性进行鉴定。结果　制备出抗PSCA单克隆抗体 ,免疫扩散鉴定为IgG1亚类 ,ELISA法测定其腹水效价为 5× 1 0 -5。组织学检查与前列腺癌组织呈阳性反应 ,与其他肿瘤组织均呈阴性反应 ,和人体正常组织细胞无一出现阳性反应。结论　初步制备出一株抗PSCA的单克隆抗体细胞株 ,能特异性识别前列腺癌组织 ,对前列腺癌的诊断和治疗提供有用的工具。     

氯霉素单克隆抗体的制备与纯化

目的制备氯霉素(CAP)单克隆抗体。方法用人工合成抗原氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体,用间接竞争ELISA法和间接ELISA测定抗体特异性。结果得到两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-4以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,回收率达80%,抗体活性好并且与BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等无交叉反应。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,对动物性食品中CAP的检测具有较大的价值。     

ATP柠檬酸裂解酶鼠源单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）鼠源单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），并进行相关的特异性鉴定。方法：该研究采用原核表达的重组蛋白ACLY为抗原免疫6~8周龄Balb/c雌性小鼠，利用杂交瘤融合细胞技术构建稳定分泌ACLY McAb的杂交瘤细胞，用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光（IF）、Western-blot、免疫组织化学（IHC）、流式细胞术（FCM）等鉴定其生物活性，检测所得抗体的特异性。结果：复筛后获得了一株能稳定分泌ACLY McAb的杂交瘤细胞（5F8D11），Ig亚类为IgG1，轻链为κ链；Western-blot、IHC、IF分析和ELISA检测证实该株ACLY McAb与ACLY具有较高的特异性。结论：该株抗ACLY特异性的McAb的成功制备，为检测ACLY蛋白表达水平及研究ACLY在肿瘤及心血管疾病中的致病机制提供有力的工具，将有助于对肿瘤及心血管疾病患者制定多样合理的治疗方案。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用

目的  建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV）D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价。方法  以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水。牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体（多抗）和小鼠单抗。以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA。对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证。结果  纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80%和90%以上。经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000、1:10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1:10 000、1:20 000、1:10 000。建立的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4~13.0、0.4~12.0和0.4~20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99。该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应。用该法对高、中、低浓度样品进行测定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值（×100%）分别为97%～111%、91%～104%和95%～102%、相对标准偏差分别为≤7%、≤9%和≤10%;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势。结论  建立了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价。     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。     

小鼠HSP27/HSPB1单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备针对热休克蛋白27/热休克蛋白B1(HSP27/HSPB1)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用HSP27/HSPB1作为免疫抗原免疫BalB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,进行克隆化培养后接种于小鼠腹腔制备HSP27/HSPB1单克隆抗体,并利用间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光技术对所制备的抗体进行鉴定。结果获得了一株可稳定分泌HSP27/HSPB1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为4C9C7,其亚类是IgG1,分泌的单克隆抗体能特异性结合组织和细胞中的HSP27/HSPB1蛋白。结论本实验成功制备了可稳定分泌HSP27/HSPB1单克隆抗体的杂交瘤细胞及HSP27/HSPB1特异性的单克隆抗体,可应用于各种相关的科学研究。     

人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化

目的制备人绒促性素(hCG)单克隆抗体。方法hCG抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合,间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行克隆化培养;制备腹水抗体;间接ELISA法测定抗体效价;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-3以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单抗纯度达98%以上,回收率达75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。