shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

shRNA抑制人RPE细胞HIF-1 α基因表达对VEGF及PEDF表达的影响

目的利用小发卡环RNA（shRNA）使缺氧培养条件下的人视网膜色素上皮（RPE）细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因沉默，观察对血管内皮生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的影响。方法体外转录法合成对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA，对缺氧（150μmol／LCoCl2模拟）培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰，使用RT—PCR检测HIF-1α、VEGF和PEDFmRNA的表达及Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF和PEDF蛋白水平。结果HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达，同时也有效地抑制VEGFmRNA和蛋白表达，并促进PEDF蛋白表达，但对PEDFmRNA的表达无影响。结论HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默，进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用，同时也促进PEDF表达。揭示了HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关，是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。     

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1/VEGF信号通路的抑制作用

背景 视网膜新生血管(RNV)是多种眼底血管疾病的共同表现,研究证实胰岛素样生长因子(IGF-1)能够刺激血管内皮细胞的增生,从而促进新生血管的形成,而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用.但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚.目的 研究PSF对IGF-1/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的调控作用.方法 将猕猴视网膜血管内皮细胞RF/6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组,分别在细胞中转入真核质粒Pegfp-C2-PSF、pGenesil-PSF-RNAi及相应的空白质粒.各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)以刺激细胞生长,采用MTT法检测各组RF/6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量,用于进一步的实验.采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF/6A细胞中VEGF mRNA的表达;采用Western blot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶(ERK)活化的促进作用.结果 IGF-1刺激后Pegfp-C2-PSF质粒转染组以0.50 μg PSF为最适剂量,其RF/6A细胞的增生率为0.220±0.020,细胞中VEGF mRNA相对表达量为0.79±0.07,分别低于其对照组的0.260±0.006和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.040、0.016);IGF-1刺激后pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组以1.00 μg PSF作为最适剂量,其RF/6A细胞增生率为0.35±0.02,VEGF mRNA相对表达量为2.29±0.43,分别高于其对照组的0.210±0.019和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.003、0.019).IGF-1刺激后1、3、6 h Pegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组,差异均有统计学意义(P=0.017、0.000、0.000).Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126+处理后细胞中VEGF mRNA的相对表达量为0.93±0.21,明显低于未转染组的1.32±0.08,差异均有统计学意义(P=0.037),同时明显低于Pegfp-C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGF mRNA的相对表达量1.23±0.09,差异有统计学意义(P=0.002).结论 PSF可抑制IGF-1诱导的RF/6A细胞中的ERK信号通路的活化,下调VEGF在RF/6A细胞中的表达,进而抑制RF/6A细胞的增生.     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HSP47表达的影响

目的 探讨曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达的影响.方法 使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟人RPE细胞缺氧环境,人RPE细胞分别在不同浓度TA的条件下培养,将其分为0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组,均加入含150 μmool·L-1 CoCl2的DMEM完全培养液采用RT-PCR检测HSP47表达,使用Western-blotting检测HSP47的蛋白水平.结果 0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组HSP47 mRNA的表达量分别为1.53±0.21、1.15±0.20、1.07±0.17,HSP蛋白表达量分别为748.62±79.03、643.76±63.18、615.62±61.77,3组间HSP47 mRNA及蛋白表达量差异均有统计学意义(F=14.729,P=0.000;F=9.438,P=0.001);0.05 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量均显著下降(P=0.000、P=0.003);0.20 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量也均显著下降(均为P=0.000);而0.05 μg·L-1 TA组与0.20 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量差异均无统计学意义(P=0.373、P=0.392).结论 HSP47对胶原的成熟起着重要的作用,TA能有效地抑制缺氧条件下人RPE细胞HSP47的表达,可能是其防治增生性玻璃体视网膜病变的一个重要机制.     

蛋白酪氨酸激酶抑制剂对RPE细胞趋化因子表达和Ca2+的影响

目的 研究蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)抑制剂染料木黄酮(Genistein)对白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞趋化因子表达和细胞内Ca2+的影响.方法 应用不同剂量IL-1β对RPE细胞进行刺激,RT-PCR法观察细胞IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaetic protein-1,MCP-1)mRNA表达的变化.应用Genistein对RPE细胞培养进行干预,观察其对IL-1β诱导RPE细胞IL-8和MCP-1 mRNA表达的影响.应用Fura2/AM、荧光分光光度计检测IL-1β和Genistein对RPE细胞内Ca2+的影响.结果 RT-PCR结果显示,0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组IL-8 mRNA相对表达值分别为0.446±0.133、0.727±0.054和0.523±0.106,对照组为0.272±0.088;1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001、0.015).10μg·L-1IL-1β诱导的RPE细胞MCP-1 mRNA相对表达值与对照组比较,差异有显著统计学意义(P=0.002).10 mg·L-1、50 mg·L-1 Genistein对IL-1β诱导的IL-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01).IL-1β引起细胞内ca2+浓度升高,Genistein对细胞内Ca2+作用与之相反.结论 Genistein对IL-1β诱导的1L-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,其机制可能为抑制IL-1β诱导的细胞内Ca2+增加.     

叔丁基对苯二酚对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞的抗氧化应激作用及其机制

目的研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)对高糖环境下SD大鼠视网膜Müller细胞氧化应激的影响及其机制。方法体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞。将实验分为正常对照组、高糖组和tBHQ干预组,采用Western blot法和实时荧光定量PCR测定各组Müller细胞核因子-E2相关因子(Nrf2)、血红素氧化酶1(HO-1)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及其mRNA的相对表达量。结果体外培养Müller细胞的细胞体扁平不规则,细胞核呈卵圆形,细胞质丰富,相邻细胞交织形成网状;Western blot法检测结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF的蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=73.831、148.618、152.269、91.217,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量分别是0.17±0.02、0.47±0.02、0.67±0.07和0.60±0.05,较正常对照组的0.06±0.01、0.19±0.03、0.06±0.00和0.07±0.02明显增加,差异均有统计学意义(t=4.114、9.275、16.479、13.353,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1蛋白表达量分别为0.40±0.06、0.72±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=7.847、7.947,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF蛋白表达量分别为0.18±0.04、0.26±0.07,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=13.215、8.444,均P=0.000)。实时荧光定量PCR测定结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=340.317、1582.911、488.852、185.699,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量分别是1.53±0.06、1.50±0.04、2.56±0.09和3.04±0.19,较正常对照组的1.07±0.07、0.95±0.05、0.99±0.02和1.09±0.08明显增加,差异均有统计学意义(t=7.292、15.014、30.550、18.573,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1mRNA相对表达量分别为2.68±0.09、2.94±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=18.046、39.458,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF mRNA相对表达量分别为1.48±0.05、1.6±0.08,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=21.036、13.739,均P<0.001)。结论tBHQ通过激活抗氧化应激Nrf2/ARE信号通路,对高糖环境下Müller细胞损伤起保护作用。     

大鼠视网膜胚胎发育过程中低氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的表达

背景研究发现低氧诱导因子-1（HIF-1）与机体缺氧的生理反应有关,并在胚胎发育过程中发挥作用。此外人视网膜胚胎发育过程中血管内皮生长因子（VEGF）呈高表达。但二者在胚胎期缺氧环境中的作用及相互关系仍有待研究。目的观察大鼠视网膜胚胎发育过程中HIF-1α和VEGF的表达变化,探讨HIF-1α和VEGF在视网膜胚胎发育过程中的作用和相互关系。方法30只清洁级SD孕鼠剖腹取出胚胎10、12、14、16、20d鼠,每组取5只孕鼠,每只孕鼠随机选取2只胎鼠进行观察。摘除胎鼠一侧眼球,分离视网膜并制备切片,用免疫组织化学法检测视网膜组织中HIF-1α、VEGF蛋白的阳性表达,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法分别检测不同胎龄大鼠及成年大鼠视网膜组织中HIF-1α mRNA及VEGF mRNA的表达。结果免疫组织化学染色表明,在大鼠视网膜胚胎早期（10～12d）即可检测到HIF-1α和VEGF蛋白均呈高表达,二者的表达强度均随胎龄的增加而减弱（F=56．70,P〈0．01;F=60．78,P〈0．01）,各胎龄组视网膜中HIF-1α和VEGF蛋白的表达量均明显高于成年鼠,差异均有统计学意义（P〈0．01）,随胎龄的增加HIF-1α蛋白在视网膜中的表达变化与VEGF蛋白表达呈正相关（r=0．96,P=0．00）。RT—PCR检测结果表明,大鼠胚胎早期（10～12d）即可检测到HIF-1α mRNA和VEGF mRNA在视网膜中均呈高表达,二者的表达均随胎龄的增加而减弱（F：68．84,P〈0．01;F=96．49,P〈0．01）,各胎龄组视网膜中HIF-1α和VEGF蛋白的表达量均明显高于成年鼠,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论大鼠视网膜胚胎发育过程中HIF-1α及VEGF的表达随着胎龄的增加均呈先高后低的动态变化趋势,提示HIF-1α／VEGF通路参与大鼠视网膜的胚胎发育过程。     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞促血管生成素-1和促血管生成素-2表达的影响

目的 探讨缺氧环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞中促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)表达变化及其可能的机制.方法 将人RPE细胞培养在厌氧箱中,以建立缺氧模型.按缺氧时间0h、1h、4h、12h和24 h分为5组,观察Ang-1、Ang-2与缺氧诱导因子-1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的变化;另取4h作为观察点,按处理因素分为缺氧对照组和HIF-1α抑制剂3-(5’-hydroxymethy1-2’-furyl)-1-benzyl indazole (YC-1)处理组,YC-1浓度分别为1μmol·L-1、10μmol·L-1和100 μmol·L-1,观察抑制HIF-1α后对Ang-1和Ang-2表达的影响. 应用免疫荧光染色法和Western blot分别检测Ang-1、Ang-2与HIF-lα蛋白的表达.结果 常氧条件下人RPE细胞内可见Ang-2蛋白表达,未见Ang-1及HIF-1α蛋白表达;缺氧条件下Ang-1和Ang-2分别与HIF-1α共表达于RPE细胞胞质中.HIF-1α与Ang-1在缺氧早期呈上升趋势,其中HIF-1α于缺氧后4h表达最高(0.451±0.022,与0h相比t=5.401,P＜0.05),24h后有所下降;Ang-1于缺氧后24 h表达最高(1.342±0.059,与0h相比t=20.100,P＜0.01);Ang-2表达几乎不变(1.542±0.129、1.621 ±0.131、1.574±0.146、1.624±0.027,与0h相比t=0.044、0.673、0.244、0.700,均为P＞0.05).浓度为1 μmol·L-、10 μmol·L-1和100 μmol·L-1的YC-1均可有效抑制HIF-1α蛋白的表达(t=21.583、27.154、27.431,均为P＜0.01).HIF-1α蛋白表达下调后,Ang-1蛋白表达也随之受到抑制(t=9.492、15.487、17.942,均为P＜0.05),而Ang-2蛋白表达无明显变化(f=0.859、0.178、1.565,均为P＞0.05).结论 缺氧条件下人RPE细胞表达Ang-1上调,并与HIF-1α表达具有时相关系,Ang-2无明显变化;抑制HIF-1α表达后,Ang-1表达随之降低.提示在脉络膜新生血管生成过程中Ang-1的表达可能受HIF-1α选择性调控.     

胰岛素样生长因子-1及其受体在晶状体上皮细胞迁移中的作用

背景 白内障囊外摘出术后发生的后囊膜混浊（PCO）与残留晶状体上皮细胞（LECs）的增生和迁徙有关,曾有研究认为,糖尿病患者后发性白内障的发生率高于正常人,而胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是否可促进LECs的迁徙尚不清楚. 目的 探讨IGF-1/IGF-1受体（IGF-1R）系统对LECs迁移能力的影响,为临床上防治PCO提供理论依据. 方法 将人永生化LECs系（HLEC-B3）细胞在DMEM中进行常规传代培养,第2代细胞采用荧光免疫组织化学法（兔抗人α-晶状体蛋白抗体）鉴定细胞.分别在培养基中加入质量浓度为0、30、90 μg/L的IGF-1培养48 h.将0、30、90 μg/L IGF-1中培养的细胞分别进行Transwell迁移小室实验,计数任意5个视野中结晶紫染色细胞,评估各组细胞的迁移能力.将细胞分别在0、1.5、30、60、90 μg/LIGF-1中培养,采用Western bolt法检测IGF-1R,包括IGF-1Rα和IGF-1Rβ亚基在各组细胞中的表达变化.结果 HLEC-B3细胞贴壁后48 h达对数生长期,培养的第2代HLEC-B3细胞对α-晶状体蛋白呈阳性反应,细胞膜呈红色荧光.各组细胞在Transwell迁移小室培养12h后,0 μg/L IGF-1组仅可见0（0,1）个染色的迁移细胞,30 μg/L IGF-1组和90 μg/L IGF-1组分别可见10（10,11）个和29（27,31）个染色的迁移细胞,30 μg/LIGF-1组和90 μg/L IGF-1组的迁移细胞数明显多于0μg/L IGF-1组,差异均有统计学意义（均P=0.008）,90 μg/L IGF-1组明显多于30 μg/L IGF-1组,差异均有统计学意义（P=0.009）.Western blot法检测发现,5个培养组细胞中IGF-1 Rα和IGF-1Rβ的表达量（IGF-1R/β-actin）差异均有统计学意义（F=63.700、130.530,均P=0.000）,当IGF-1质量浓度＞30 μg/L时,随着IGF-1质量浓度的增加,IGF-1Rα和IGF-1Rβ的表达量均逐渐升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 IGF-1能够上调HLEC-B3细胞膜上IGF-1R蛋白的表达,这种作用呈剂量依赖性;IGF-1能够增强体外培养的HLEC-B3细胞的迁移能力,提示PCO的发生可能与IGF-1/IGF-1R系统的激活有关.     

加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞增生的抑制作用

背景 黄斑区脉络膜新生血管(CNV)是致盲率较高的眼病之一,以往的主要治疗方法是光动力学疗法和玻璃体腔抗血管内皮生长因子(VEGF)药物注射,但均存在一定的不良反应.研究认为,加减驻景方的应用对相关病变有治疗效果. 目的 探讨加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞(RCVECs)增生的影响. 方法 10只SD大鼠给予0.525 g/ml加减驻景方药液20 ml/kg灌胃3d,于末次给药后2h无菌条件下采集腹主动脉血,制备加减驻景方含药血清.将培养的RCVECs分为4个组,空白对照组细胞用常规培养液进行培养,氯化钴组在培养液中添加100 μmol/L氯化钴100μl以制备细胞缺氧模型,空白血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％空白血清,含药血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％含药血清.细胞培养后24 h采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的增生情况;采用逆转录PCR和Western blot技术检测各组细胞中缺氧诱导因子-lα(HIF-lα)基因和蛋白的相对表达量.结果 培养的RCVECs生长良好,呈梭形.100 μmol/L氯化钴作用后成功建立了缺氧细胞模型.MTT法检测显示,空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组吸光度(A)值分别为0.659±0.051、0.757±0.553、0.683±0.037和0.731±0.038,其中氯化钴组A值明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(HIF-1αmRNA:F=3.100,P＜0.05;VEGF mRNA:F=3.420,P＜0.05;HIF-1α蛋白:F=470.600,P=0.000;VEGF蛋白:F=146.700,P=0.000),其中氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 加减驻景方含药血清可能通过抑制RCVECs分泌HIF-1α和VEGF的机制而抑制缺氧状态下RCVECs的增生.     

低氧诱导因子1α在急性高眼压大鼠视网膜中的表达

目的了解低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)在急性高眼压大鼠视网膜中的表达,并探讨其在急性青光眼损伤中的作用。方法 80只Wistar大鼠随机分为对照组、穿刺组、加压后2h、12h、1d、3d、7d、14d组。对照组不做任何处理,穿刺组只进行前房穿刺不加压,加压各组前房灌注加压法制作急性高眼压模型。HE染色观察视网膜的形态学变化,免疫组织化学方法和RT-PCR方法观察HIF-1α蛋白和mRNA在视网膜中的表达情况。结果急性高眼压损伤后1d,光学显微镜下可见视网膜高度水肿,7d时水肿基本消失,14d时视网膜各层结构紊乱,明显萎缩变薄。HIF-1α蛋白和mRNA在加压后2h时表达增多(HIF-1α蛋白IOD值0.54±0.06,mRNA相对表达量1.5162±0.1199),12h达到高峰(HIF-1α蛋白IOD值1.73±0.10,mRNA相对表达量2.9041±0.1690),随时间推移表达逐渐减少,14d时降至最低(HIF-1α蛋白IOD值0.52±0.03,mRNA相对表达量1.2847±0.0434),但仍高于对照组(HIF-1α蛋白IOD值0.25±0.04,mRNA相对表达量1.0009±0.0480),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论大鼠视网膜的HIF-1α在急性高眼压后表达增加,该因子在急性青光眼发病机制中具有重要作用。     

缺氧及血管内皮生长因子对视网膜色素上皮细胞Opticin蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧及血管内皮生长因子(VEGF)对视网膜色素上皮(RPE)细胞Opticin 蛋白表达的影响及其内在机制.方法 实验研究.原代培养人眼RPE细胞,取生长良好的第3～6代细胞,接种于含DMEM培养液的6孔板中,于缺氧条件下或加入不同浓度(1、10、50及100 μg/L)VEGF进行培养.逆转录聚合酶链反应(PCR)检测缺氧后RPE细胞中VEGF mRNA的表达.蛋白印迹法检测细胞内和细胞培养液中Opticin蛋白含量.明胶酶谱法检测细胞培养液中明胶酶活性.组间检测数据比较采用单因素方差分析.结果 蛋白印迹法检测,显示缺氧组RPE细胞内Opticin蛋白含量无明显变化;而RPE细胞培养液中,缺氧组Opticin蛋白含量明显下降.逆转录PCR检测,缺氧组12、24 h VEGF mRNA表达灰度值分别为0.81 ±0.04、0.67±0.07,均较正常对照组VEGF mRNA表达灰度值(0.21±0.03)明显升高,差异有统计学意义(F =483.60,P＜0.05).添加不同浓度的外源性VEGF后,RPE细胞内Opticin蛋白表达无明显变化;添加1、10、50及100μg/L的外源性VEGF后,RPE细胞培养液中,Opticin蛋白表达灰度值分别为0.65 ±0.02、0.52±0.04、0.23±0.03、0.30±0.03,均较正常对照组Opticin蛋白表达灰度值(0.73 ±0.04)明显下降(F=141.38,P＜0.05).明胶酶谱法分析,显示与基质金属蛋白酶-2相对应的位置出现明显的消化条带,且酶的活性随VEGF浓度的增加而递增.低浓度的乙二胺四乙酸可抑制由VEGF引起的RPE细胞培养液中Opticin蛋白含量减少.结论 缺氧及VEGF作用可影响RPE细胞培养液中Opticin蛋白分泌,可能与增多的基质金属蛋白酶-2对Opticin蛋白的酶解作用有关.     

NADPH氧化酶4抑制剂对缺氧诱导的人RPE细胞中VEGF表达的抑制作用

目的观察还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶4(NOX4)抑制剂对缺氧诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将APRE-19细胞分为Avastin干预组和VAS2870干预组,并按照药物剂量不同将Avastin干预组亚分为常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组,将VAS2870干预组亚分为1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组,缺氧对照组采用终浓度为300μmol/L CoCl2处理ARPE-19细胞以建立细胞化学缺氧模型。采用细胞免疫荧光染色技术对不同干预组细胞中NOX4和VEGF表达进行测定和定位,采用Western blot法对不同干预组细胞中NOX4和VEGF蛋白相对表达量进行测定和比较。结果Western blot法检测显示,常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组NOX4蛋白相对表达量分别为0.657±0.153、1.000±0.200、1.206±0.300、1.260±0.200和1.413±0.273,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.821±0.110、1.210±0.100、0.672±0.100、0.340±0.120和0.300±0.130,组间总体比较差异均有统计学意义(F=17.631,P<0.001;F=4.777,P=0.020),其中0.75 mg/ml Avastin干预组细胞中NOX4蛋白表达量明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.001),0.25、0.50和0.75 mg/ml Avastin干预组VEGF-A表达量均明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。常氧对照组、缺氧对照组及1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4的蛋白相对表达量分别为0.970+0.120、1.060+0.130、0.880+0.130、0.567+0.135和0.450+0.120,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.387+0.135、0.627+0.125、0.370+0.140、0.363+0.140和0.160+0.100,组间总体比较差异均有统计学意义(F=12.933,P<0.001;F=4.948,P<0.05),其中3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.001);1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中VEGF-A蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论NOX4抑制剂可抑制人RPE细胞中VEGF-A表达。     

缺氧对视网膜色素上皮细胞基质细胞衍生因子-1和整合素连接激酶表达的影响

背景 缺氧是诱导新生血管形成的主要因素,近年来越来越多的研究证实基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和整合素连接激酶(ILK)在新生血管性疾病中发挥着重要作用,而缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞SDF-1和ILK表达的影响尚未阐明. 目的 探讨缺氧对体外培养RPE细胞中SDF-1和ILK表达的影响.方法 从4周龄SPF级健康C57BL/6小鼠眼球中获取RPE组织并进行消化和培养,将达到80％融合的细胞进行传代.取第3代细胞制作细胞爬片后用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫组织化学检测和鉴定,以5×104个/ml密度将RPE细胞接种于含胎牛血清的DMEM/F12培养液的培养瓶中,无血清饥饿培养24 h后常氧组在常规培养基中进行培养,缺氧组在CoCl2浓度为200 μmol/L的含胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行培养,2个组根据培养时间的不同再亚分为1、3、6、12、24、48、72h组.采用逆转录PCR(RT-PCR)检测RPE细胞中SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达,采用Western blot检测RPE细胞中SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达,均以目的基因A值/β-actin A值表示.结果 培养的RPE细胞呈不规则多边形,细胞质内布满黑色素颗粒,90％以上的细胞对CK18呈阳性反应.随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量逐渐增加,总体比较差异均有统计学意义(SDF-1 mRNA:F=281.875,P=0.000;ILK mRNA:F=187.566,P=0.000),12h达高峰,之后略有降低,但仍高于常氧组,缺氧1h组SDF-1 mRNA及蛋白表达无明显变化;缺氧培养3、6、12、24、48、72 h组SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量均明显高于常氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.01).随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(SDF-1:F=44.719,P=0.000; ILK:F=144.481,P=0.000).缺氧1h组SDF-1及ILK蛋白表达无明显变化;缺氧3、6、12、24、48、72 h组SDF-1蛋白、ILK蛋白表达明显升高,与常氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 SDF-1和ILK参与了RPE细胞的缺氧反应,并且在缺血缺氧性视网膜病变的发生发展过程中可能发挥一定的作用.     

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子干扰性RNA抑制鼠视网膜新生血管的研究

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 本研究采用随机对照方法.构建HIF-1αsiRNA重组质粒.C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pEGFP-N1,1 d后视网膜铺片观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达.选7天龄C57BL/6J小鼠90只,17只为正常组,73只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,分为模型对照组、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA组、VEGF siRNA组及共转染组).于出氧舱前1 d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α siRNA组注射HIF-1α siRNA,VEGF siRNA组注射VEGF165 siRNA,共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165 siRNA.采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;制作组织切片计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达.采用单因素方差分析和组间最小显著差法进行统计学分析.结果 pEGFP-N1经脂质体LF2000介导转染视网膜细胞后1 d即可见GFP表达.基因治疗组较模型对照组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,其中共转染组效果最明显.基因治疗组[HIF-1α siRNA组为(27.73±2.33)个,VEGF siRNA组为(15.43±3.23)个,共转染组为(8.70 ±2.88)个]较其他3组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均具有统计学意义(F=3016.527,P＜0.01).视网膜HIF-1α mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.08±0.06,0.383±0.009)和空载体组(1.09±0.05,0.386 ±0.010)较正常组(0.81 ±0.07,0.035±0.003)上调,而HIF-1α siRNA组(0.46±0.06,0.182±0.008)较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异均有统计学意义(F=139.804,2686.001;P＜0.01).VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.53 ±0.07,0.340±0.004)和空载体组(1.59±0.06,0.337±0.009)较正常组(0.27±0.08,0,051±0.008)明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义(F=421.423,2513.583;P＜0.01),其中共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%.结论 HIF-1α siRNA和VEGF165siRNA均可有效抑制小鼠视网膜新生血管形成,两种siRNA共转染抑制效果最明显.     

叔丁基对苯二酚对2型糖尿病大鼠视网膜细胞的保护作用及其机制

背景 细胞凋亡是糖尿病视网膜病变(DR)中的重要机制之一,氧化应激、高糖等可启动细胞凋亡通路,从而造成细胞损伤.叔丁基对苯二酚(tBHQ)是一种抗氧化应激药物,但其在DR的发生和发展过程中是否发挥视网膜细胞的保护作用尚不明确. 目的 观察tBHQ对2型糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)及Bcl-2表达的影响,探讨tBHQ通过核因子-E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路对2型糖尿病大鼠视网膜可能的保护机制.方法 选取50只清洁级健康雄性SD大鼠.应用随机数字表法随机选取其中10只大鼠为正常对照组,以正常饲料喂养;其余40只大鼠采用高脂高糖饲料喂养4周后空腹12h,然后大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病模型.造模成功大鼠均衡分组,模型对照组大鼠继续给予高脂高糖饮食,tBHQ干预组大鼠于造模后1周在高脂高糖饲料中添加质量分数1％ tBHQ进行干预,各组大鼠分别于造模后4周和12周收集大鼠心脏全血,检测各组大鼠空腹血糖(FPG),血浆总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;采用放射免疫分析法检测各组大鼠空腹血清胰岛素(FINs)含量.采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中VEGF、bcl-2蛋白的表达分布;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法定量检测各组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA和VEGF mRNA的相对表达量. 结果 35只大鼠成功建立2型糖尿病模型.各组大鼠造模后不同时间点FINs含量总体比较差异均有统计学意义(F分组=22.480,P=0.000;F时间=7.636,P=0.008).各组间大鼠血浆FPG、TC、TG和LDL-C含量总体比较差异均有统计学意义(FPG:F分组=78.531,P=0.000;TC:F分组=28.049,P=0.000;TG:F分组=13.108,P=0.000;LDL-C:F分组=6.804,P＜0.05).免疫组织化学检测显示,Bcl-2和VEGF蛋白主要表达于视网膜各层的血管、视网膜神经节细胞(RGCs)层、内核层和外核层.各组间大鼠视网膜中VEGF和bcl-2蛋白的相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=11.805,P=0.000;bcl-2:F分组=22.943,P=0.000);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中bcl-2蛋白的相对表达量明显高于造模后4周,差异有统计学意义(P＜0.05).各组大鼠造模后不同时间点视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=79.220,P=0.000;F时间=6.090,P＜0.05;Bcl-2:F分组=105.000,P=0.000;F时间=13.170,P=0.001).其中造模后4周和12周模型对照组和tBHQ干预组大鼠视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,tBHQ干预组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于造模后4周,差异均统计学意义(均P＜0.05). 结论 tBHQ可通过下调视网膜中VEGF的表达和上调bcl-2的表达对DR发挥抗氧化损伤和抗凋亡作用.此外,tBHQ对糖尿病大鼠可能有降血糖、调节胰岛素、降血脂的作用.     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

缺氧诱导因子-2α在增生型糖尿病视网膜病变新生血管形成中的作用

目的观察HIF-2α在增生型糖尿病视网膜病变(PDR)纤维血管膜中的表达,初步探讨HIF-2α在PDR新生血管形成中的作用。方法回顾性临床研究。2014年7月至2015年7月于青岛大学附属医院眼科行玻璃体切割手术的PDR患者57例60只眼纳入研究。根据手术前是否行玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗将患眼分为PDR未注药组和PDR注药组,分别为30例32只眼、27例28只眼。PDR注药组患眼手术前2~7 d玻璃体腔注射10 mg/ml雷珠单抗0.05 ml(含雷珠单抗0.5 mg)。选取同期特发性黄斑前膜患者18例18只眼作为对照组。于玻璃体切割手术中获得PDR纤维血管膜、黄斑前膜病理标本。免疫组织化学染色法及荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组病理标本中HIF-2α、Delta样配体4(Dll4)、VEGF的表达。多组间相关因子表达差异比较采用Kruskal-Wallis检验。两变量间关系行Spearman相关性分析。结果免疫组织化学染色结果显示,PDR未注药组、PDR注药组纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达均呈阳性。PDR未注药组HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白相对表达量均高于PDR注药组,差异均有统计学意义(t=4.36、6.01、4.82,P=0.000、0.008、0.016)。RT-PCR检测结果显示,PDR未注药组、PDR注药组、对照组纤维血管膜、黄斑前膜中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量比较,差异均有统计学意义(H=18.81、19.60、20.50,P=0.000、0.000、0.000)。其中,PDR未注药组、PDR注药组HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量均显著高于对照组;与PDR未注药组比较,PDR注药组HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量均降低。Spearman相关性分析结果显示,HIF-2α与Dll4、VEGF mRNA相对表达量呈显著正相关(r=0.95、0.87,P<0.05)。结论PDR患眼纤维血管膜中HIF-2α表达高于对照组,且与DLL4、VEGF的表达均呈显著正相关。