超声微泡造影剂用于基因转染方面的辐照参数优化

随着微泡作为一种新型基因载体可行性[1]研究的逐步深入和超声介导微泡破坏增强基因转染机制认识的不断加深,超声与微泡在基因治疗领域中的应用日益广泛。目前,国内外学者在这方面开展了大量的研究,在其过程中超声辐照参数的选择尤为重要,如何选择最佳的超声辐照条件是许多学者     

超声介导SonoVue微泡破裂促进报告基因在肝脏中表达的实验研究

目的:探讨超声介导SonoVue微泡破裂法促进外源基因在肝脏中表达的作用,评估其转染效率、安全性。方法:经SD大鼠门静脉置管输入SonoVue微泡建立动物模型,以虫荧光素酶基因为报告基因,观察不同浓度的微泡促进虫荧光素酶基因在肝脏中的表达强度与持续时间,实验结束后采下腔静脉血检测肝肾功能并取肝、肾组织常规HE染色行组织学检查。结果:随着微泡浓度的增加,虫荧光素酶基因表达逐渐增加,在微泡浓度为100%(V/V)时,转染效率最高,持续到21天仍有表达。转染前后的肝肾功能(AST、ALT、ALB、BUN、Cr)无明显变化,HE切片未发现肝肾组织结构的改变。结论:超声介导微泡破裂法能有效地促进外源基因在肝脏中的表达,为肝脏疾病的基因治疗提供了新的途径。     

超声联合微泡促进大鼠损伤跟腱及肉芽组织局部基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合微泡促进基因局部转染大鼠损伤跟腱及肉芽组织的最适超声转染条件。方法 建立双侧大鼠跟腱损伤模型,在大鼠双侧损伤跟腱内局部注射微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒混合溶液,应用不同输出功率、占空比及超声辐照时间的超声辐照双侧损伤处跟腱,根据荧光染色及免疫组化染色下EGFP表达结果判断转染效果。根据基因转染效果最高,同时正常组织损伤坏死最小筛选出最合适的照射条件。将大鼠分为4组:①质粒+微泡+超声辐照组,②质粒+微泡组,③质粒+超声辐照组,④单纯质粒组。根据前几步所选取的条件辐照损伤跟腱,观察跟腱及肉芽组织内的EGFP表达情况及正常组织损伤情况。 结果 在超声输出功率2 W/cm2、占空比20%、超声辐照10 min条件下,跟腱及肉芽组织内EGFP表达明显,且无明显正常组织损伤。超声辐照+微泡+质粒组跟腱及肉芽组织内EGFP表达高于其余3组（P<0.05）,其余各组间差异无统计学意义。结论 在适合的超声辐照条件下,超声联合微泡能明显增强损伤肌腱及肉芽组织的基因转染效果,且不损伤正常组织,这为肌腱损伤的基因治疗的可行性提供了实验基础。     

超声及超声微泡介导基因转染的安全性研究

目的:探讨超声及超声微泡介导基因转染的安全性。方法:将人脐静脉内皮细胞分别按超声辐照时长及所加入的微泡剂量分组,超声辐照后分别培养24h及48h,应用台盼蓝拒染法进行细胞计数,与对照组进行比较。超声辐照含有不同微泡剂量的细胞后,行扫描电镜观察细胞膜形态。结果:不同辐照时长组经超声辐照后培养24h,10min、15min、30min组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05);继续培养48h,各组与对照组比较无统计学差异。不同微泡剂量组经超声辐照5min后培养24h,200μl、500μl组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05);继续培养48h,500μl组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05)。扫描电镜可见超声辐照后细胞膜完整性变差,继续培养24h后有一定程度改善。结论:超声辐照+微泡对细胞增殖有一定的抑制作用,对细胞膜有一定程度的损害,但这些作用在超声辐照时长不超过5min及微泡剂量不超过100μl时是轻微、可逆的。超声及超声微泡介导基因转染是相对安全的。     

超声微泡破碎技术促进人MxA基因在小鼠肝脏转染的实验研究

目的:观察静脉注射基因和微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏的方式是否能增强外源MxA基因在小鼠肝脏中的定位表达,并探讨不同辐照参数对该基因表达的影响.方法:(1)不同转染方法对转染效率的影响:采用昆明小鼠24只,随机分为4组.分别为质粒转染组、微泡+质粒组、超声+质粒组和微泡+超声+质粒组.7 d后分别取肝、心、脾、肾、肺和骨骼肌,采用间接免疫荧光法进行MxA蛋白的半定量检测.(2)不同辐照参数对基因表达的影响:采用昆明小鼠20只,随机分为4组.按转染不同超声辐照声强分为0.25 W/cm2组、0.5 W/cm2组、0.75 W/cm2组和1.0 W/cm2组.7 d后分别取肝组织,采用间接免疫荧光法进行MxA蛋白的半定量检测.结果:(1) 肝脏每高倍视野表达阳性细胞数在微泡+超声+质粒组最高,其次为超声+质粒组,再次为微泡+质粒组,表达最少的为质粒组;各组间两两比较,均有显著统计学差异(P<0.001);超声+微泡+质粒组中检测发现,脾组织偶有MxA表达阳性细胞,其余各组仅在肝组织存在MxA表达.(2)肝脏每高倍视野表达阳性细胞数0.5 W/cm2组最高,其次为0.75 W/cm2组,再次为1.0 W/cm2组,0.25 W/cm2组表达最少;各组间两两比较,均有显著统计学差异(P<0.001).结论:超声微泡破碎技术能显著增强外源MxA基因在小鼠肝脏中的靶向性表达;超声辐照频率不变的条件下,在一定范围内增加声强,能促进外源MxA基因在小鼠肝脏表达;当声强为0.5 W/cm2时,转染率最高;该技术生物安全性好,为肝脏疾病的基因治疗提供了一项高效、安全的转染技术.     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

超声联合微泡介导基因转染对内皮细胞骨架的影响

目的 探讨白蛋白微泡在治疗性超声条件下对介导基因转染以及对细胞骨架的影响,同时探讨超声联合微泡介导基因转染的最佳声学参数.方法 六孔板培养大鼠微血管内皮细胞,一组每孔加入eGFP质粒10μg,加或不加微泡,超声条件为连续波,频率2 MHz,机械指数是0.50～1.80.照射时间是30～180 S,24～48 h后观察细胞转染情况.一组超声照射后免疫荧光染色细胞骨架,荧光显微镜观察并测定荧光强度.结果 机械指数为0.50～1.00范围内,基因转染率与机械指数呈正相关(P<0.001),再增加机械指数基因转染率差别无统计学意义.超声照射时间30～90 S范围内,基因转染率以及微管荧光强度改变与超声照射时间呈正相关(P<0.001).再延长照射时间基因转染率差别无统计学意义.同种条件下,微丝蛋白荧光强度改变无统计学意义(P>0.05).结论 超声联合微泡能够显著增加报告基因的转染率并且对细胞骨架无明显的损伤.微泡可以作为临床冠心病基因治疗的安全有效的载体.     

携自杀基因微泡转染卵巢癌细胞株SKOV_3的超声参数及转染效率

目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1tk)自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率.方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间(8,15,30,60s间隔1s)组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度.将实验分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,裸质粒组(阴性对照),脂质体组(阳性对照).用裸质粒及脂质体处理后分别转染pcDNA3.1-EGFP/hsv1tk质粒;采用荧光显微镜、流式细胞技术分别定性和定量检测各组转染效率;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hsv1tk基因的表达.结果:MTT检测在超声强度0.5W/cm2,频率1MHz,微泡浓度0.56×1011个/L,辐照时间8s间隔1s条件下,超声辐照微泡转染对细胞活性无明显抑制.经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为(11.74±0.19)%,比超声辐照组(2.19±0.22)%高,而脂质体+微泡+超声辐照组(25.62±0.08)%均高于其他各组(P<...     

超声辐照超声微泡介导siRNA 转染膀胱癌T24细胞的实验研究

 目的探讨超声辐照超声微泡介导siRNA 转染人膀胱癌T24 细胞的有效性。方法使用超声辐照超声微泡的方法介导FITC-siRNA转染人膀胱癌T24 细胞,通过荧光显微镜及流式细胞学方法观察siRNA的转染效率,使用MTT方法观察细胞活力。结果与各阴性对照组相比,超声辐照超声微泡的方法可以明显增加siRNA向T24 细胞中的转染效率。随着超声辐照强度的增加,siRNA的转染效率在一定范围内有所提高,同时也增加了对T24细胞毒性。与脂质体介导的siRNA体外转染相比,超声辐照超声微泡介导的siRNA 转染效率仍然较低。结论超声辐照超声微泡能够有效提高siRNA 转染膀胱癌细胞的效率,有可能为膀胱癌的基因靶向治疗提供新的转染手段。     

超声靶向微泡破碎介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的 探讨超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数.方法 体外培养HepG2细胞,在治疗超声的不同声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中...     

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系。方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB／c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率。结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFP-C1基因转导,HepG2细胞以1MHz 1．5W／cm^2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1MHz3W／cm^2的超声波转基因效果最好。结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1MHz超声波是转基因的理想频率。     

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系.方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB/c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率.结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFP C1基因转导,HepG2细胞以1 MHz 1.5 W/cm2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1 MHz 3 W/cm2的超声波转基因效果最好.结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1 MHz超声波是转基因的理想频率.     

微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因转染血管平滑肌细胞

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因转染体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的可行性.方法 实验分为A、B、C、D、E5组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组.用重组真核表达载体pcDNA3.1- eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠VSMCs,辐照条件为超声探头频率为10 MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10 min,重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-eNOS 5μg/mL.辐照48 h后,采用RT-PCR、Western blot及免疫组化检测VSMCs内eNOSmRNA和蛋白的表达.结果 RT -PCR检测E组eNOS mRNA的表达最显著,积分吸光度(IA)比值为(91.11±3.41)％,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％,与E组相比均P＜0.05.蛋白印迹分析eNOS蛋白表达,A组有极少量表达,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％,而E组表达最明显,IA比值为(84.22±9.22)％,与各组相比均P＜0.05.结论 超声辐照结合微泡造影剂能显著提高eNOS基因在VSMCs的转染效率,提高细胞内一氧化氮合成酶的表达.     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

微泡造影剂结合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染大鼠移植静脉的实验研究

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导基因转染移植静脉桥的可行性.方法 建立SD大鼠颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,选择增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)为报告基因.将大鼠颈外静脉段浸泡入粘附质粒的微泡中,予超声照射,再将静脉段间置植入颈总动脉,7 d后,取出静脉段行快速冰冻切片,荧光显微镜下观察血管平滑肌内荧光表达,同时进行苏木精-伊红染色行病理观察.结果 微泡造影剂结合超声辐照组的荧光强度显著高于质粒浸泡+超声辐照组、质粒+微泡造影剂组及单纯质粒浸泡组(P<0.05).苏木精-伊红染色观察血管组织并无坏死灶出现.结论 微泡造影剂结合超声辐照可以实现基因靶向转染至大鼠移植静脉桥的血管平滑肌中.     

超声联合微泡造影在分子影像诊断及治疗中的研究进展

超声造影技术是近十年来超声医学的重要发展方向,是超声发展史上的第三次革命。超声造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)在临床上已应用于包括肾脏、甲状腺、乳腺等多个器官疾病的诊断,大大提高了超声诊断的准确性,靶向微泡的出现更为超声分子影像提供了可能。微泡造影剂也是一种有效的药物或基因载体,通过局部超声辐照破坏微泡,实现药物或基因的定位释放,可以达到靶向治疗的目的。关注超声联合微泡造影在基础研究及临床中的进展,提高研究级临床认识水平,必定能促进超声微泡造影更多、更好的应用。     

超声对曼月乐环治疗子宫腺肌病的临床疗效观察

目的 探讨超声对曼月乐环(左炔诺孕酮宫内缓释系统,LNG-IUS)治疗子宫腺肌病的临床疗效.方法 超声随访观察65例子宫腺肌病患者放置曼月乐前后子宫体大小、内膜厚度、子宫肌壁回声及双侧附件区的变化.结果 放置曼月乐1个月后,子宫内膜明显变薄,差异有统计学意义(P＜0.05);放置12个月后,子宫体大小有缩小,但差异无统计学意义(P＞0.05).放置6个月后子宫肌壁弥漫性病变回声多转变为局灶病变回声,附件区囊肿缩小.结论 定期的超声检查是随访观察曼月乐治疗子宫腺肌病疗效较直观简便的方法.     

靶向超声介导VEGF165基因治疗左向右分流肺动脉高压兔模型的实验性研究

目的探讨靶向超声介导VEGF165基因治疗左向右分流兔模型肺动脉高压的可行性.方法将30只肺动脉高压兔随机分为实验1组、实验2组和对照组各10只,实验1组采用超声破坏微泡造影剂的方法将VEGF165基因转染兔,实验2组静脉输入同等量携带VEGF165基因的造影剂,对照组静脉输入同等量单纯造影剂,14 d后处死.处死后免疫组织化学检测肺组织中的VEGF蛋白表达及毛细血管记数.结果实验1组中可见大量VEGF阳性反应的棕褐色颗粒,而实验2组、照组肺组织中仅有极少量的VEGF阳性反应的颗粒,其差异具有明显统计学意义(P<0.05).实验1组平均毛细血管密度(MDV)为(387.35±12.80)个/高倍视野,组间比较有显著差异.实验1组(WT%)、(WA%)比对照组和实验2组明显减小,其差异有统计学意义(P<0.05).结论超声介导微泡造影剂携带VEGF165基因能提高基因转染率,促进肺内毛细血管再生.     

40例陈旧性周围神经损伤修复探讨

目的：探讨陈旧性周围神经损伤的修复方法及价值。方法：对４０例陈旧性周围神经损伤的修复及肢体功能恢复情况进行分析。结果：２８例陈旧性神经离断行神经外膜对端吻合及神经移植术，恢复优１３例，良４例；１２例行神经探查、减压松解术，恢复优７例，良３例。总优良率６７５％。结论：对陈旧性神经损伤采用多种方法修复是有价值的，修复后辅从康复治疗对肢体功能恢复具有重要意义。