球孢白僵菌侵染的柞蚕蛹体壁和脂肪体组织病理观察

【目的】探究球孢白僵菌Beauveria bassiana穿透柞蚕Antheraea pernyi蛹体壁和侵染其脂肪体的过程,进一步明确其对柞蚕蛹的致病机理。【方法】利用扫描电镜技术观察球孢白僵菌穿透柞蚕蛹体壁的病理变化,并运用透射电镜技术观察球孢白僵菌侵染的柞蚕蛹脂肪体的病理变化。【结果】扫描电镜观察结果显示:在球孢白僵菌侵染柞蚕蛹体表过程中,分生孢子主要侵染气门、刚毛根部和头部与胸部的节间膜等部位。分生孢子除了从气门、刺突、头部和胸部的节间膜进入体内以外,也可以直接穿透厚而坚硬的体壁进入体内。透射电镜观察结果显示,脂肪体中,球孢白僵菌首先侵染细胞器(线粒体除外),然后再侵染脂肪滴。被侵染的脂肪滴颜色变浅,表面出现许多孔洞,变形,分裂成小的脂肪滴进而完全被侵蚀。蛹僵硬时,脂肪体细胞完全被破坏,只观察到芽生孢子和菌丝。【结论】柞蚕蛹经体表侵染和注射侵染球孢白僵菌处理后,蛹的体壁和脂肪体两组织都发生了明显的病理变化。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。     

家蚕细胞中过表达家蚕核型多角体病毒核衣壳蛋白VP39抑制BmNPV的增殖

【目的】家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）核衣壳蛋白VP39为病毒装配所必需。本研究旨在初探VP39在病毒侵染家蚕细胞过程中的功能及特征,以期为家蚕抗病毒研究提供研究基础。【方法】本研究通过构建原核表达载体,诱导原核表达得到多克隆抗体,以Western blot验证VP39表达时相;构建真核表达载体,转染细胞后以免疫荧光手段观测VP39表达定位及影响病毒增殖现象。【结果】制备了VP39多克隆抗体。VP39在病毒感染后大量定位于家蚕细胞核,部分定位于胞质,而过表达的VP39定位于家蚕细胞胞质;过表达VP39后抑制BmNPV感染家蚕细胞。【结论】在BmN-SWU1细胞中过表达VP39会影响BmNPV的扩散,导致BmNPV感染细胞数目大量减少。该结果为VP39调控宿主与病毒的相互作用提供了新的思路。     

家蚕C类清道夫受体BmSR-C的基因克隆、原核表达及亚细胞定位

【目的】本研究旨在克隆与鉴定家蚕Bombyx mori C类清道夫受体基因BmSR-C,为探析其在家蚕免疫中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆家蚕C类清道夫受体基因全长序列,并对其进行生物信息学分析。利用RT-PCR和qPCR方法对BmSR-C基因的时空表达情况进行检测。通过原核表达和Ni~+亲和层析的方法获得BmSR-C重组蛋白,免疫昆明小鼠制备抗BmSR-C多克隆抗体。利用ELISA法和Western blot分别对鼠抗BmSR-C蛋白多克隆抗体的效价和特异性进行检测。构建家蚕BmSR-C的真核表达载体,转染家蚕BmE细胞,分析该蛋白的亚细胞定位情况。【结果】克隆获得家蚕BmSR-C基因(GenBank登录号:BGIBMGA004577),其开放阅读框(ORF)全长为1 821 bp,编码606个氨基酸残基。BmSR-C具有典型的C类清道夫受体家族结构特征,主要由CCP, MAM和SO结构域以及靠近C端的单次跨膜结构域组成。进化分析结果显示鳞翅目昆虫SR-C单独聚为一支,家蚕BmSR-C与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和大红斑蝶Danaus plexippus的同源蛋白亲缘关系最为接近。对BmSR-C基因的时空表达分析表明,BmSR-C在家蚕的马氏管和血细胞中高表达,而在其他组织中无明显表达;其在家蚕不同发育时期的血细胞中均有表达,且在4龄眠期的表达量达到峰值。ELISA检测结果显示,所制得抗体效价高达1∶128 000;Western blot检测结果显示,该抗体可以特异性识别重组蛋白。家蚕BmE细胞中的亚细胞定位结果表明BmSR-C主要定位于细胞膜。【结论】获得家蚕C类清道夫受体基因BmSR-C的完整cDNA序列及其表达特征;成功制备了BmSR-C的多克隆抗体,利用家蚕BmE细胞在细胞水平上分析了BmSR-C的亚细胞定位情况,推测其参与家蚕的生长发育及病原微生物入侵的免疫反应,为进一步研究BmSR-C的生物学功能奠定了基础。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

家蚕生殖细胞相关基因nanos的克隆表达及在胚胎发育中的表达模式

【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyx mori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684 bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684 bp的编码片段,得到了分子量约33 kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。     

BmSPI38同型串联多聚体在大肠杆菌中的表达和抗真菌活性

本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白,并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明,基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明,基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明,His₆-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His₆-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示,能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达,并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力,不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略,还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。     

球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析

【目的】克隆与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的高渗适应性相关基因,并对其功能进行分析,以揭示球孢白僵菌对高渗等逆境适应的分子机理。【方法】利用YADE法克隆T-DNA的侧翼序列并进行基因组步行,获得突变基因的全长及上游序列;利用RT-PCR技术分析突变基因的表达特性以及与Bbhog1的关系;采用同源重组技术敲除Bbmpd基因。【结果】克隆得到插入突变基因及其上、下游序列全长3037bp。该基因与编码球孢白僵菌的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因相似性为98%。Bbmpd的表达受高渗环境(0.8mol/L NaCl)的诱导,受Bbhog1信号途径的激活调节,Bbhog1缺失导致Bbmpd表达下调。Bbmpd缺失突变体在高渗胁迫下的生长受到明显抑制。Bbmpd缺失不影响球孢白僵菌在查氏培养基上的生长和产孢。【结论】由T-DNA突变体克隆了编码球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因Bbmpd,该基因的表达受高渗环境的诱导和Bbhog1的调控,与球孢白僵菌高渗适应性相关。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART, 多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号: XM_038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域,而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示,Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高,在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征,为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。     

家蚕微孢子虫感染对家蚕海龟蛋白(Bmtutl)基因表达水平的影响

【目的】本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况。【结果】家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高。但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异。qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显：Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%。【结论】家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达。结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用。     

双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并 折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。     

家蚕BmlncR2036调控P25基因启动子活性及参与中肠发育调控

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)对家蚕Bombyx mori发育具有重要调控作用。我们在前期研究中发现一个位于家蚕丝素蛋白基因P25附近的lncRNA BmlncR2036。本研究旨在进一步探索BmlncR2036调控家蚕P25基因表达的分子机制。【方法】qPCR检测BmlncR2036在5龄第3天家蚕幼虫不同组织(体壁、脑、神经、精巢、卵巢、丝腺、马氏管、血淋巴、脂肪体和中肠)中和不同发育阶段前丝腺、中丝腺和后丝腺中的表达谱。预测能够同时靶向P25和BmlncR2036的miRNA,利用荧光素酶检测法验证miRNA与P25互作关系。荧光素酶检测法测定BmlncR2036对P25基因启动子转录活性的影响。在家蚕5龄第3天幼虫中注射dsRNA敲低BmlncR2036的表达,观察丝腺及中肠表型的变化。【结果】qPCR结果显示,BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫和5龄熟蚕的后丝腺中高表达,与P25基因呈现一致的表达趋势;BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫的精巢和中肠中高表达,在其他组织中表达量较低,暗示其功能的多样性。miR-2739和miR-279a既能够与BmlncR2036匹配,也可能靶向P25基因的3′UTR。但荧光素酶检测法结果显示P25不是miR-2739和miR-279a的真实靶标。BmlncR2036负调控P25启动子活性,共转染pcDNA3.1(+)［BmlncR2036］和pGL3-Enhancer［P25-promoter］载体后,细胞荧光素酶活性极显著下降了52%。在家蚕5龄第3天幼虫中敲低BmlncR2036表达后出现体色变暗,中肠残留大量内容物,直至死亡的现象,表明BmlncR2036可能参与家蚕中肠的发育调控。【结论】发现lncRNA BmlncR2036可调控P25基因启动子活性,还可能参与调控家蚕中肠的发育。本研究为进一步探索家蚕lncRNA的功能提供了实验依据。     

东方蜜蜂微孢子虫一新型孢壁蛋白的基因克隆、 表达及亚细胞定位

【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜蜂微孢子虫新型孢壁蛋白AAJ76_1400036761序列进行生物信息学分析。利用PCR法获取目的片段并将其克隆至原核表达载体pCold II中,利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以获得的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术和免疫胶体金定位技术对该蛋白进行亚细胞定位分析;利用蛋白质免疫印迹法检测该蛋白与东方蜜蜂微孢子虫几丁质壳的互作。【结果】在MicrosporidiaDB数据库中获得AAJ76_1400036761基因序列,基因全长681 bp,编码226个氨基酸;预测等电点为6.84,分子量为26.19 kD。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明AAJ76_1400036761重组蛋白能够在大肠杆菌Eescherichia coli Rosetta中高量表达。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体能够特异地识别东方蜜蜂微孢子虫总蛋白中的AAJ76_1400036761,说明其在成熟东方蜜蜂微孢子虫中有表达。亚细胞定位结果显示,AAJ76_1400036761定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上。重组蛋白AAJ76_1400036761能够与蜜蜂微孢子虫的几丁质壳结合。【结论】AAJ76_1400036761蛋白在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中有表达;该蛋白定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上,为东方蜜蜂微孢子虫新的孢壁蛋白。本研究为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

棉铃虫Ⅳ型几丁质酶的基因克隆、酶学性质及表达谱

【目的】昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigera Ⅳ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树。在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Western blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质。qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号: MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD。蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain, CAD), C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain, CBD)。多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶。重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达。纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数K_m和V_max值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s。qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达。【结论】结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程。这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息。     

LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析,进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据,我们发现在蜕皮激素20E(2 μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调,家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2 μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析;采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位;利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达,并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明,lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰;二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达;lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调,24 h下降到与对照组相当水平,二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核,但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后,Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达,还可诱导lncRNA63的核质迁移;lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。     

A novel protease inhibitor in Bombyx mori is involved in defense against Beauveria bassiana

Entomopathogenic fungi, such as Beauveria bassiana, penetrate the insect cuticle using a plethora of hydrolytic enzymes including cuticle-degrading proteases and chitinases, which are important virulence factors. The insect integument and hemolymph contains a relatively high concentration of protease inhibitors, which are closely involved with defense against pathogenic microorganisms. To elucidate the molecular mechanism underlying resistance against entomopathogenic fungi and to identify a new molecular target for improving fungal resistance in the silkworm, Bombyx mori, we cloned and expressed a novel silkworm TIL-type protease inhibitor BmSPI38, which was very stable over a wide range of temperatures and pH values. An activity assay suggested that BmSPI38 potently inactivated the insecticidal cuticle-degrading enzyme (CDEP-1) produced by B. bassiana and subtilisin A produced by Bacillus licheniformis. The melanization of silkworm induced by CDEP-1 protease could also be blocked by BmSPI38. These results provided new insights into the molecular mechanisms whereby insect protease inhibitors provide resistance against entomopathogenic fungi, suggesting the possibility of using fungal biopesticides in sericulture.