原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU-87PCNA mRNA的表达水平.结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU-87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组.结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现.     

脱氧核酶对人食管癌细胞增殖的影响

目的 :探讨针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因起始密码AUG的脱氧核酶 (DNAzyme)对人食管癌细胞(EC970 6 )增殖的影响。方法 :设计合成DNAzyme ,应用脂质体转染法将其转入体外培养的hEC。采用流式细胞仪测细胞周期 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析hEC增殖活性。采用免疫组化 (SABC法 )检测PCNA蛋白表达。结果 :2 .0 μmol/LDNAzyme干预EC970 6 3d后 ,MTT比色吸光度值低于对照组 (P <0 .0 1)和反义寡聚核苷酸 (ASODN)组 (P<0 .0 5 )。DNAzyme和ASODN对吸光度值的抑制呈剂量依赖性。细胞干预 2d后 ,DNAzyme和ASODN均减少细胞核中棕黄色颗粒的表达 ;DNAzyme、ASODN和对照组的G0 /G1期细胞的比率分别为 72 .5 %、6 6 .8%和 5 6 .7%。结论 :针对PCNA的DNAzyme能调控细胞周期 ,有效抑制EC970 6的体外增殖。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU—87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡脱氧苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU－87 PCNA mRNA的表达水平。结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU－87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组。结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU－87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现。     

PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

谷氨酰胺酶反义基因对胃癌细胞恶性增殖的逆转作用

目的利用反义核酸技术封闭胃癌细胞的谷氨酰胺酶（glutaminase,GA）基因,观察反义GAcDNA对胃癌细胞恶性增殖能力的影响。方法构建含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3．0／GA,经脂质体介导转入胃癌细胞SGC-7901（命名为SGC-7901^GA）,并对胃癌细胞生长曲线、细胞核增殖抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达、软琼脂克隆形成试验进行观察。结果与对照组比较,8GC-7901^GA在各时相点的细胞生长数目显著性降低（P〈0．05）,PCNA表达较对照组显著下降,在软琼脂上克隆形成数减少。提示SGC-7901^GA生长速度减慢,增殖活性明显减弱。结论通过特异性抑制GA基因的表达,反义GAcDNA对胃癌细胞恶性增殖能力有显著抑制作用。     

反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果　成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P <0 0 1)。反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P <0 0 1)。 结论　应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 ,为基因治疗提供了新思路     

脂质体介导10-23脱氧核酶对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :研究针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因特异性的 10 - 2 3脱氧核酶 (DNAzyme)对人血管平滑肌细胞(VSMC)PCNA的表达和细胞增殖的影响。方法 :应用脂质体转染法将不同寡聚核苷酸转入体外培养的人脐动脉VSMC。采用3 H -TdR掺入法观察空白对照组、脂质体组和等摩尔浓度 (1.0 μmol/L)的DNAzyme、反义寡核苷酸 (A SODN)、mDNAzyme在干预 2d后VSMC的DNA合成速率 ;免疫组化检测 1.0 μmol/L的DNAzyme和ASODN转染 2d后对PCNA表达的影响 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析不同剂量的DNAzyme(0 .12 5、0 .2 5、0 .5、1.0、2 .0 μmol/L)转染5d后VSMC增殖活性。结果 :1.0 μmol/LDNAzyme和ASODN转染 2d后 ,VSMC的3 H -TdR掺入量均较对照组显著减低 (P <0 .0 5 ) ,DNAzyme较ASODN更显著减低 (P <0 .0 5 ) ;1.0 μmol/LDNAzyme作用 2d后细胞增殖抑制率为 6 4 .5 % ,高于ASODN组 (37.7% )、mDNAzyme组 (11.9% )和脂质体组 (3.3% )。DNAzyme和ASODN处理细胞 2d后 ,PCNA的表达水平 (平均光密度值 )分别为 0 .2 95 6± 0 .0 2 5 1和 0 .3880± 0 .0 92 5 ,明显低于空白对照组 0 .7342± 0 .2 136 (P <0 .0 1)。转染 5d后 ,DNAzyme的作用呈剂量依赖性 ,0 .12 5 μmol/LDNAzyme处理后VSMC的增殖较对照组低 (P <0 .0 5 )。     

RAB5A反义寡脱氧核苷酸抑制大肠癌细胞转移侵袭的实验研究

目的 应用RAB5A反义寡脱氧核苷酸(ASODN)体外转染高转移度的大肠癌细胞LS174T,观察其对肿瘤细胞的增殖、侵袭和运动的影响,初步探讨RAB5A在大肠癌转移中的作用与机制.方法 用脂质体将RAB5A转染人大肠癌高转移细胞LS174T,细胞增殖抑制实验(MTT法)检测RAB5A反义寡核苷酸对细胞的生长和增殖的影响;Transwell小室法检测对细胞的侵袭和运动能力的影响,明胶酶谱法检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的分泌与活性的变化;RT-PCR法检测大肠癌细胞的RAB5A的mRNA表达.结果 RAB5A-ASODN能抑制大肠癌高转移细胞LS174T的增殖和高转移大肠癌细胞的浸润和运动能力,并能抑制基质金属蛋白酶的分泌和活性.RAB5A-ASODN组RAB5A表达量比对照组明显减少.结论 在体外抑制RAB5A的表达可抑制大肠癌的转移.     

DADS对人结肠癌SW480细胞系增殖的影响

目的观察二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌SW 480细胞增殖的抑制作用。方法实验分DADS处理组和未处理组。MTT法、集落形成实验检测细胞增殖活性,光镜和电镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测周期分布,免疫细胞化学检测增殖细胞核(PCNA)表达改变。结果MTT和集落形成实验显示DADS作用SW 480细胞后,细胞生长抑制率呈浓度、时间依赖性增加,而集落形成率显著降低;组织学显示处理组细胞异型性降低,核质比下降,细胞器丰富;流式细胞仪分析显示DADS明显将细胞周期阻滞于G2/M期,且呈剂量依赖关系;免疫细胞化学显示处理组较未处理组细胞PCNA蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论DADS可体外抑制人结肠癌SW 480细胞增殖,使癌细胞阻滞于G2/M期,可能与下调PCNA蛋白的表达有关。     

脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.     

增殖细胞核抗原反义核酸对人肝癌细胞增殖的抑制作用

目的 观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）反义核酸对人肝癌细胞的抑增殖效应。方法 设计针对ＰＣＮＡｍＲＮＡ的１８个碱基的反义核酸,分反义组、正义组和空白组作用于ＨｅｐＧ－２肝癌细胞,ＭＴＴ法和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法观测肝癌细胞的生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果 反义组肝癌细胞生长受到明显抑制,抑制作用于培养４８ｈ达高峰,达５０％左右,７２ｈ后减弱,９６ｈ已基本消失。反义组肝癌细胞与空白对照     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对裸鼠肝癌生长的影响

目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对裸鼠人肝癌生长的抑制作用。方法 接种传代培养的人肝癌细胞于裸鼠皮下,接种后24h内局部注射PCNA反义寡核苷酸进行治疗。观察裸鼠的体重变化、瘤体大小,计算抑瘤率。HE染色观察肝癌组织结构和细胞形态改变。结果 PCNA反义寡核苷酸治疗组裸鼠肝癌的生长受到抑制,抑瘤率为72．8％。瘤重、肿瘤体积明显小于正义寡核苷酸治疗组及对照组。镜下见PCNA反义寡核苷酸治疗组肝癌细胞部分细胞形态呈梭形,核分裂相较少见,细胞的异型性较小。结论 PCNA反义寡核苷酸能显著抑制裸鼠肝癌的生长。     

PCNA反义寡核苷酸治疗裸鼠骨肉瘤的效应

目的探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用。方法制备BALC／C裸鼠皮下骨肉瘤模型12只，随机分为PCNA反义寡核苷酸治疗组和对照组，每组6只。接种MG-63人成骨肉瘤细胞后24h内用PCNA反义寡核苷酸皮下注射进行治疗，对照组只注射生理盐水，每周2次，连续4周；观察各组裸鼠肿瘤的生长情况、裸鼠的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠，游标卡尺测量肿瘤体积大小，天平称量肿瘤的重量。结果PCNA—ASODN治疗组裸鼠骨肉瘤的生长受到抑制，抑瘤率为46．53％。结论PCNA反义寡核苷酸对骨肉瘤的生长具有抑制作用，通过反义技术可抑制靶基因的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

KDR反义寡核苷酸对人前列腺癌PC-3细胞增殖调控的研究

目的探讨血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain-containing receptor,KDR)反义寡核苷酸(antisense oligode-oxynucleotides,ASODN)对人前列腺癌PC-3细胞的增殖调控作用。方法设计并合成KDR的正义、反义寡核苷酸,经脂质体介导转染人前列腺癌PC-3细胞。用噻唑盐法观察不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)正义、反义寡核苷酸及阳离子脂质体对肿瘤细胞增殖的抑制作用,RT-PCR方法检测不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)ASODN转染后KDRmRNA的表达情况,流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡。结果转染ASODN后48 h达抑制高峰,低浓度(0.01μmol/L)即发生抑制,抑制强度与反义寡核苷酸浓度有相关性,而正义寡核苷酸和阳离子脂质体对PC-3细胞的增殖无显著影响。转染KDR反义寡核苷酸各浓度组细胞中KDR mRNA的表达都不同程度地降低,各浓度组与空白对照组相比KDR mRNA表达的差异有统计学意义。各组均出现不同程度的细胞凋亡,但各浓度组间细胞周期分布无显著性差异。结论 KDR基因在促进人前列腺癌PC-3细胞增殖中发挥着一定的作用,有望成为治疗雄激素非依赖性前列腺癌的分子靶点。     

Livin反义寡核苷酸诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究

目的 探讨Livin反义寡核苷酸(ASODN)对人肾癌细胞株786.O Livin mRNA及蛋白表达的抑制作用以及对细胞凋亡的影响.方法 设计合成全硫代磷酸化修饰的Livin ASODN,脂质体辅助转染至786-O细胞内.采用RT-PCR检测转染后Livin mRNA的变化,细胞免疫化学、激光扫描共聚焦显微镜观察Livin蛋白在细胞内的分布、转染后表达的变化及细胞形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,激酶法测定Caspase3活性的变化.结果 转染Livin ASODN后,RT-PCR显示786-O细胞表达Livin mRNA减少(P＜0.01),激光扫描共聚焦显微镜下见细胞表达Livin蛋白减少、细胞形态发生变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率显著增加(P＜0.01),Caspase3活性明显增加(P＜0.01).结论 Livin ASODN能明显下调786-O细胞Livin基因的表达,诱导细胞凋亡.抑制Caspase3活性是Livin抑制细胞凋亡的途径之一.     

c－Ha－ras and c－myc antisense oligodeoxynucleotides inhibit the proliferation and DNA synthesis in human gastric carcinoma cel

ｃ－Ｈａ－ｒａｓａｎｄｃ－ｍｙｃａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓＤｅｎｇＪｉａｎｂ...     

脂质体介导Bcl-2反义寡核苷酸对胆管癌细胞株QBC939的作用

目的：观察Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞的作用及对Bcl-2蛋白表达的影响。方法：脂质体LipofectamineTM2000介导Bcl-2 ASODN转染QBC939细胞,应用台盼篮拒染实验检测细胞存活率、克隆形成实验检测克隆形成率、Western blot检测Bcl-2蛋白表达。结果：Bcl-2 ASODN转染后Bcl-2蛋白免疫印迹条带光密度显著低于对照组（P<0.01）;台盼篮拒染实验和克隆形成实验均显示Bcl-2 ASODN可以部分抑制QBC939细胞增殖,经ASODN作用,细胞的存活率和克隆形成率均显著低于对照组（P<0.05）。结论：Bcl-2 ASODN通过封闭人胆管癌QBC939细胞bcl-2基因表达抑制人胆管癌QBC939细胞的增殖。     

c-Ha-ras和c-myc反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长增殖的影响

作者观察了人工合成的反义c-Ha-ras和 c-myc寡聚脱氧核昔酸(ASO-r,ASO-m)对两株胃癌细胞中Ha-ras癌基因表达和细胞生长增殖的影响。观察到ASO-r能显著抑制MGc-803细胞P21蛋白合成(作用12 h抑制率达48.10％,P<0.01),同时对其DNA合成和细胞增殖也有较显著的抑制作用(抑制率分别为76.79％,55.61％,P<0.05)。ASO-r对SGc-7901细胞的DNA合成和细胞增殖也有类似的抑制作用(抑制率分别为76.78％,62.02％,P<0.05)。ASO-m对两株细胞的细胞增殖和SGc-7901细胞DNA合成均无明显影响,仅对MGc-803细胞的DNA合成有抑制作用(抑制率为71.37％,P<0.05)。结果表明:ASO-r能够阻断c-Ha-ras癌基因表达,并抑制胃癌细胞生长增殖;c-Ha-ras癌基因可能是维持胃癌细胞恶性生长表型的主要因素。     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。