酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞

目的采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病的研究提供大量的原代平滑肌细胞。方法无菌取老龄SD大鼠主动脉,采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞,自然纯化及差速贴壁纯化血管平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。结果免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。结论酶消化法用于血管平滑肌细胞的培养有利于获得大量的高纯度细胞供实验研究。     

施万细胞高效体外传代培养的实验研究

目的探讨获取大量高纯度施万细胞（SC）的体外培养纯化方法。方法取6-7 d SD乳鼠坐骨神经,立体显微镜下机械性剥除神经外膜与束膜,采用低浓度胰酶消化法和差速贴壁法去除成纤维细胞,阿糖胞苷与G enetic in联合应用进行SC纯化,牛脑垂体提取物（BPE）促进SC增殖。结果经形态学及S-100蛋白相关抗原免疫细胞化学染色鉴定证实所获得的SC状态良好,纯度较高,可达96%以上。结论本方法可以体外获取大量、高纯度的SC,为神经组织工程的研究奠定了实验基础。     

不同分离纯化法建立人早孕滋养细胞模型的效果比较

目的：对4种建立滋养细胞的方法进行比较,以期寻求一种简便高效的人早孕滋养细胞的体外培养方法,为相关研究提供基础。方法早孕绒毛通过胰酶联合胶原酶消化分离后,分别采用直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法、完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离法4种方法纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,应用 HE 染色、免疫组化和免疫细胞化学法检测细胞纯度。结果直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法得到的细胞细胞角蛋白7（CK －7）表达阳性率不足60％;简化的 percoll 密度梯度分离法得到的细胞 CK －7表达阳性率达90％以上。结论完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离纯化可以得到大量较高纯度的滋养细胞以供后期实验。     

激活态雪旺细胞体外培养与纯化的新方法

目的：探求一种快速培养高纯度激活态雪旺细胞的新方法。方法：wistar大鼠坐骨神经体内切断后7d,取预变性坐骨神经,综合运用混合酶消化、三次组织块移植法,原代提取雪旺细胞,低酶双差速纯化雪旺细胞,不做任何处理的坐骨神经作为对照组。结果：此法培养的雪旺细胞纯度为97．8％左右,细胞增殖能力是未做预变性组的5倍。结论：体内预变性、体外两步酶消化-三次组织块移植结合低酶双差速纯化是一种简便、快速的原代培养、纯化雪旺细胞的方法。     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础.方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AEC Ⅱ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant protein c,SPC)的表达.结果:每3～5只胎鼠可获得AEC Ⅱ(36 ± 5)× 106,活力98%±2%.镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形.透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上.结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AEC Ⅱ,能满足体外进一步实验的需要.     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的 通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础.方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片;采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用"差速贴壁法"进行纯化.通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定.结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用"差速贴壁法"可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞.     

嗅内衬细胞的培养

目的 :探索一种简单的培养纯化嗅内衬细胞的方法。方法 :取新生 2 0 d的大鼠嗅球表层 ,以阿糖胞苷和牛垂体提取液分别作用 ,应用差速贴壁分选方法纯化培养细胞 ,以P75NGFR抗体鉴定。结果 :取得了较高纯度的嗅内衬细胞。结论 :应用阿糖胞苷和牛垂体提取液 ,联合差速贴壁分选法是有效可行的获取高纯度嗅内衬细胞的方法。     

新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方法:取新生5~7天SD大鼠,分离小脑皮质,胰酶消化后差速贴壁,种植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内,第3天加入阿糖胞苷纯化神经元;采用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经元。结果:细胞存活率达(98±1.07)%;24 h内基本贴壁;第3天细胞突起增多、变长;培养6~8天,细胞突起交织成网,形成典型的神经细胞网络;神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占90%左右。结论:实验获取神经元纯度较高,是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。     

新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞传代培养实验研究

目的探索简便可行的、可以获得高纯度的雪旺细胞的培养方法。方法选用4—5d的SD大鼠将双侧坐骨神经进行结扎预变性,术后7d采用在解剖镜下剥离除去神经外膜,剪碎后采用双酶消化法和原代培养4d后G-418纯化法进行雪旺细胞培养,并对培养的细胞进行细胞计数、活力测定和免疫组织化学染色法鉴定。结果从新生鼠可获取近3．84×10^6个雪旺细胞,成活率为95．6％,免疫组织化学染色法鉴定雪旺细胞纯度达94％以上。结论建立的方法可以获得大量纯度高、活性良好的雪旺细胞,值得进一步推广。     

人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞的分离培养方法

目的:建立一种经济、高效的人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞分离、培养方法.方法:胶原酶、胰酶联合消化蜕膜组织,网筛过滤、密度梯度离心及差速贴壁法纯化细胞;免疫细胞化学法鉴定细胞纯度;MTT增殖实验分析细胞体外增殖活力.结果:利用此法可成功体外培养蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞,细胞纯度可达90％以上,并在体外呈现良好的生长状态.结论:此法经济、高效,能够同时获得纯度较高的蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞.     

Experiments on Gene Transferring to Primary Hematopoietic Cells by Liposome

GenetransferintohematopoieticcelIshasmanyexperimentalaswellasclinicalapplications['].Atpresenttime,thestrategyofgenetransferusedmostlyistheretroviralvectorsystem['].However,theuseofretroviralvectorssuffersfromseveraldrawbacks:(l)thegenerationandmanufacturingofretroviralvectorsarecomplexandnotinexpensive;(2)generalsafetyconcernsareassociatedwiththeuseofanyviral--basevectorssystem,includingrepli-cationdefectivemurineretroviraIvectors;(3)retro-viralvectorscurrent1yusedareabletotransduceon1ydividi…     

一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法

目的 探索一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法。 方法 摘取小型猪胰腺,经胰管插管后注入胶原酶V,用自制的半自动消化分离装置消化,胰腺消化物经自制的推进式离心管及单一密度（1.096g/ mL）的ficoll400纯化后行双硫腙（DTZ）染色,倒置显微镜下观察计数胰岛的数量及纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果 纯化后平均每克小型猪的胰腺可以获得（2 645 ±234）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（74.2 ±5.1）%。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时的胰岛素释放量为低糖时的3.14倍(P<0.01)。 结论 为小型猪胰岛细胞的研究建立了一种简单快速分离纯化胰岛的方法,纯化后的胰岛细胞功能良好。     

siRNA干扰人宫颈癌基因(HCCR)的表达对胰腺癌PANC1细胞增殖?凋亡和侵袭的影响

目的:建立稳定转染人宫颈癌癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,探讨siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:通过脂质体转染法将含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测PANC1细胞中HCCR的表达,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化;MTT比色法检测siRNA干扰后对PANC1细胞增殖能力的影响:Transwell侵袭实验观察siRNA干扰后对PANC1细胞侵袭能力的影响.结果:Western blot证实siRNA稳转组的PANC1细胞株和空载体稳转组比较HCCR蛋白表达水平下调,稳转细胞株建立成功.siRNA稳转组p53蛋白表达下降.siRNA稳转组的S期细胞数目减少而G0/G1期细胞数目增加,细胞凋亡增加.MTT结果显示siRNA稳转组1和稳转组2细胞吸光度分别为空载体组细胞的0.65倍和0.68倍,细胞增殖能力下降.Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组细胞和空载体组细胞穿膜数分别为24.4±9.9和49.1±15.4(P＜0.01),稳转组细胞侵袭能力下降.结论:siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡.     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层细胞粘附活性的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上的粘附影响。方法运用双酶两步消化法对SC进行体外分离、培养、纯化,将bFGF-PLGA缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与SC及SIS进行体外复合培养,并以游离bFGF组及单纯培养液组进行对比,观察bFGF-PLGA缓释微球对SC在SIS上粘附影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的雪旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7天,培养后2～7天为对数生长期,第7天后进入生长平台期;bFGF缓释微球能持续地促进雪旺细胞在SIS上的粘附、增殖及迁移;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使SIS上的SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与bFGF含量的相关系数为0.988（P=0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论 bFGF-PLGA微球的药物缓释促进了SC在SIS上持续而稳定的粘附,为以SC复合SIS构建人工神经提供了有利条件。     

流式细胞术辅助筛选和纯化人缺氧诱导因子-1α基因沉默肝癌细胞株

目的利用流式细胞术（FCM）协助筛选、纯化RNA干扰（RNAi）效率高的人缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）基因沉默肝癌细胞株.方法选择带Neor及GFP基因的质粒pGenesil-1.1构建HIF-1α靶向小干扰RNA（siRNA）重组表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721.首先用G418筛选,然后用FCM检测出常氧、缺氧条件下HIF-1α蛋白表达抑制效率最高的转基因细胞株.根据FCM可分选GFP阳性细胞这一特点,进一步用流式细胞分选仪分选纯化转基因细胞,最后用PCR和免疫组化方法鉴定纯化细胞株的HIF-1α干扰效率.结果单用G418筛选HIF-1α干扰组细胞最高筛选效率为32.9%,FCM检测HIF-1α蛋白抑制率为78.7%～92.8%;合并使用G418和FCM分选纯化后,最佳HIF-1α干扰组筛选效率达94.4%,常氧、缺氧条件下对HIF-1αmRNA表达抑制率分别为95.5%、85.2%.结论合并使用G418及FCM分选纯化得到了高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌细胞株,为进一步研究HIF-1α与肝癌关系及靶向HIF-1α的肝癌基因治疗提供了实验基础.     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层增殖活性的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上增殖影响。方法运用双酶两步消化法对 SC 进行体外分离、培养、纯化,将 bFGF-PLGA 缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与 SC 及 SIS进行体外复合培养,并以游离 bFGF 组及单纯培养液组进行对比,观察 bFGF-PLGA 缓释微球对 SC 在 SIS 上增殖影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的许旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7d,培养后2～7d 为对数生长期,第7d 后进入生长平台期; bFGF 缓释微球能持续地促进许旺细胞在 SIS 上的增殖;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使 SIS 上的 SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与 bFGF 含量的相关系数为0.988（P =0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论bFGF-PLGA 微球的药物缓释促进了SC 在SIS 上持续而稳定的增殖,为以SC 复合SIS 构建人工神经提供了有利条件。     

人胚胎脊髓背根雪旺氏细胞的培养

目的探索人胚胎雪旺氏细胞的分离、培养和纯化的方法,为将来雪旺氏细胞移植奠定基础。方法从胎儿脊髓背根中分离培养雪旺氏细胞,利用雪旺氏细胞与纤维母细胞的不同贴壁特性,综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法,达到分离和纯化人雪旺氏细胞的目的。结果雪旺氏细胞大部份呈梭形,两端有突起,少数呈多角形。免疫组化示这些细胞呈S-100抗原阳性,细胞纯度达99%。结论本方法分离、培养的人雪旺氏细胞纯度高,是一种有效的培养方法。